园艺植物遗传育种 课件 第八章 诱变育种

园艺植物遗传育种第一章

绪论第二章经典遗传与细胞质遗传第三章数量遗传第四章园艺植物种质资源与引种驯化第五章选择育种第六章有性杂交育种第七章杂种优势利用第八章诱变育种第九章现代生物技术育种第十章新品种的审定与推广繁育实训1-15第八章诱变育种8.1诱变育种的概念和意义

8.1.1概念和发展概况8.1.2意义

8.2诱变育种的遗传基础

8.2.1染色体数目的改变8.2.2染色体结构的改变8.2.3基因突变和表观遗传变异8.3辐射育种

8.3.1辐射诱变源的种类及特性8.3.2辐射诱变的作用机制8.3.3辐射诱变的方法8.3.4辐射育种程序8.4化学诱变育种

8.4.1化学诱变的特点8.4.2化学诱变剂的种类、特性和诱变机制8.4.3化学诱变的方法8.5多倍体育种

8.5.1多倍体的特点8.5.2人工获得多倍体的方法8.6航天与离子注入诱变育种

8.6.1航天育种8.6.2离子注入诱变育种

练习与思考

本章小结知识目标●了解诱变育种的地位和特点●了解航天和离子注入诱变育种的概况●理解诱变育种的概念●理解染色体数目和结构变异、基因突变和表观遗传变异的相关知识●理解物理诱变与化学诱变的不同特点●掌握利用物理和化学等诱变育种的技术能力目标●能分析染色体变异的遗传学效应●能开展物理和化学诱变育种8.1诱变育种的概念和意义诱变育种（mutationbreeding），又称引变育种或突变育种，是人为利用物理和化学等因素诱发作物产生遗传变异，在短时间内获得有利用价值的突变体，根据育种目标要求，对突变体进行选择和鉴定，直接或间接地培育出新品种的育种途径。8.1.1概念和发展概况

1927年，MullerHJ和StadlerＬＪ几乎同时采用Ｘ线，分别诱发果蝇和玉米突变成功；1937年，BlakesleeAF等利用秋水仙碱诱导植物多倍体获得成功。通过这些试验发现，经诱变的后代突变的频率比自然突变大得多，从而开创了物理和化学的诱变育种工作。到20世纪50年代，由于原子技术广泛应用，采用辐射育种比化学诱变育种更为普遍。近几十年来，通过诱变在果树、蔬菜、园林等植物中都获得了许多有利的突变体，并进一步培育成为新品种。据不完全统计，1966—1995年的30年中，我国通过诱变育成的作物品种总数为459个，其中园艺植物品种数为89个，占19.4％。随着技术研究的深入，诱变育种在创造园艺植物新品种中将显示出更大的潜力。特别是随着近年来我国在航天和重离子注入诱变育种领域所取得的开创性成绩，相信诱变育种的前景将更加广阔。诱变育种在下述各方面显示出突出的作用地位。（１）提高突变频率、扩大“变异谱”、创造新类型利用辐射诱发突变，变异频率较自然突变可提高100～1000倍，而且变异的类型多、范围广。植物的高突变频率和广泛的遗传变异，为选择提供了丰富的材料。若将诱变材料进行组织培养，有可能大大提高诱变频率和扩大“变异谱”。8.1.2意义花卉植物的观赏性状是多方面的，有观花的、观叶的和观果的等，而且对观赏性状在不同时期有不同的要求，因此不论在叶形、花型、花色、株型等方面的突变都能构成观赏效果。花卉不像果树、蔬菜要获得综合性状好的果实或产品器官，因此对其采取诱变育种更容易收到效果。有些无性繁殖的园艺植物常是不育的三倍体或进行单性生殖，不能采用常规方法获得杂交种子，而利用辐射诱变方法处理植株的无性器官，可在营养生长阶段直接发现、选择突变，这就为该类植物选育新品种提供了可能性。（２）适于改良品种的个别性状在现有许多园艺植物良种中，还有某些性状不符合现代化品种要求。为改进个别不良性状，如采用杂交和选择等常规育种方法，由于基因的分离和重组，往往会引起原有优良性状组合解体；有时则可能由于某些有利基因与不利基因是连锁的，造成这些有利基因控制的性状得到改良，而相应的一些不良性状无法得到改良。由于诱变处理易于诱发点突变（pointmutation），如果应用诱变处理，则可能打破二者之间的连锁，或者发生个别基因的突变，经过分离选择，有可能获得只改造原品种个别缺点而不损伤其他优良性状的突变体。在无性繁殖植物上诱变育种效果明显。许多园艺植物虽也可以采用有性繁殖，但它们常是高度杂合的，且多数是多倍体或非整倍体，因此通过杂交或种子繁殖，后代差异性极大，要在它的实生苗后代中选择只有某些性状得到改良而又保持原品种其他优良特性不变的个体是很困难的。所以，这类植物的品种改良常依赖于选择自然发生的芽变。采用辐射诱变的方法，特别是对观赏植物，可以达到保持其他性状不变而只改良某一、两个性状的效果，如在原花色、花型的基础上诱变使某些性状发生改变，就可获得一系列的花色、花型的突变体，使其更有观赏价值。（３）诱变处理比较简单，可缩短育种年限通常应用实生选种、杂交育种等方法获得种子后，从种子播种到开花结果需要经过较长期的培育、选择和鉴定。以木本园艺植物最为明显。其童期长，杂合度高，利用常规杂交育种方法，既费时间，又难以预测其结果，而诱变育种则可大大加速育种进程。因此，对于无性繁殖的果树和部分花卉植物，诱变育种显得特别有利。当诱发出现某些优良性状（如无核果实）时，即可进行嫁接繁殖，可以早结果、早鉴定，并能把优良的突变迅速固定下来。例如，果树采用有性杂交方法选育一个新品种需要长达20～30年的时间，而用辐射诱变方法仅需10年左右。此外，辐射材料（外照射）不带有放射性物质，处理方法也比较简便，有利于推广普及应用。（４）变异方向和性质不易控制由于对诱变机制方面知之甚少，诱变后代多数是劣变，有利突变只有少数，变异方向和性质很难进行有效预测和控制。因此，如何提高突变频率、定向改良品种性状、创造新的优良品种，还需要进行大量的深入研究。（５）与其他育种方法结合使用，将发挥其巨大的作用①与杂交育种结合诱发突变获得的突变体具有所需要的性状，可通过选择和杂交等手段转移到另一个品种上，或将某个品种的优良性状转移给突变体，或通过突变体之间彼此杂交，有可能创造更优异的新品种。②与远缘杂交结合远缘杂交中可应用诱变因素来处理花粉，以克服远缘杂交的不亲和性，促进杂交结实，使远缘杂交获得成功。③与离体培养结合植物的组织、花粉和原生质体通过离体培养再生植株，离体培养过程中可发生变异，也可通过人工诱变的方法处理植物的组织和细胞，使培养物发生变异，这在品种遗传改良上更具独特的优点。首先，是在极小的空间内处理许多均一的单细胞；其次，是单细胞的突变不会受到相邻细胞的掩蔽，不会产生嵌合体；再次，利用适当的技术和选择剂，容易将突变细胞从大量混合细胞群中有效地筛选出来。除了单细胞（或原生质体）外，多细胞的愈伤组织等也可用于诱变处理。由于愈伤组织最终可分化出许多植株，因此，愈伤组织诱变处理后形成的突变细胞就有可能最终形成生殖细胞，并通过有性世代遗传给子代，从而增加离体培养再生植株后代的遗传变异，创造更多变异选择的机会。8.2诱变育种的遗传基础许多无性繁殖的植物容易用营养器官如叶、花梗、球茎块、鳞茎片等进行离体培养，也容易产生不定芽，因此为辐射诱变与离体培养技术的结合应用提供了更多的可能性。这样就可以通过组织培养的实验室操作，在较短的时间内分离体细胞突变，并在较小的空间内进行组织培养，使其栽入田间后能较快地选育出人们需要的新品种。诱变育种是人为地利用物理和化学等因素诱发植物产生遗传变异（染色体改变和基因突变）的结果。它以染色体改变或基因突变为基础，因此有必要先了解染色体改变和基因突变等问题。染色体的改变包括两大类型，一是染色体数目的改变，二是染色体结构的改变。无论是哪一种改变，都会影响生物体的遗传性状。每种生物的染色体数目是恒定的。观察二倍体细胞时，银杏有24条染色体，配成12对；洋葱有16条染色体，配成８对；杜鹃花有26条染色体，配成13对。如果用n表示单倍体细胞中一套染色体的数目，则银杏n＝12，２n＝24；洋葱n＝８，２n＝16；杜鹃花n＝13，２n＝26（表8.2.1８）。染色体数目的改变可分为整倍体（euploid）的改变和非整倍体（aneuploid

）的改变。8.2.1染色体数目的改变整倍体整倍体是指染色体数目是单倍体数目的整倍数。例如，四倍体的染色体数目是单倍体的４倍，如n＝８，则４n＝32。凡是染色体数目是单倍体数目３倍以上的统称为多倍体（polyploid）。大多数真核生物的体细胞是二倍体（diploid），配子是单倍体（haploid）。但多倍体高等植物配子的染色体数目就不止是１套。例如，六倍体普通小麦的配子中染色体是３套基本染色体组。此时，一套基本染色体组称为１X，n＝３X，２n＝６X。具有３个以上的相同染色体组的细胞或个体称为同源多倍体（autopolyploid）。多倍体细胞里的染色体组来自不同的亲本，称为异源多倍体（allopolyploid）。这些概念都可应用于育种。例如，我国遗传学家鲍文奎从普通小麦同黑麦（Secale

cereale）杂交得到的异源八倍体小黑麦（Triticale）中选育出一些品种，具有抗逆能力强、穗大、子粒蛋白质含量高、生长优势强等优良性状。非整倍体非整倍体是指整倍体染色体中缺少或额外增加１条或若干条染色体，一般是在减数分裂时一对同源染色体不分离或提前分离而形成n－１或n＋１的配子。这类配子彼此结合或同正常配子（n）结合，产生各种非整倍体细胞。正常的２n个体又可称为双体（disome），即在减数分裂时，所有染色体都能两两配对。双体包括二倍体和偶数异源多倍体。双体中缺少１对同源染色体，称为缺体（nullisomic），即２n－２；双体中缺了１条染色体，使某１对同源染色体只剩１条，称为单体（monosomic）即２n－１；如果双体中缺了２条非同源染色体，成为２n-１-１，称为双单体；如双体中多了１条染色体，使某一对同源染色体变成３条，就称三体（trisomic），即２n＋１；双体中某一对同源染色体变成４条同源染色体，称为四体（tetrasomie），即２n＋２；双体中增加了２条非同源染色体，称为双三体（ditrisomic），即２ｎ＋１＋１。非整倍体在遗传学研究和育种试验上均有很大的作用。例如，单体使１条染色体失去了同源染色体而处于半合子（semizygote）状态，此时一些等位基因就可以直接显现出来，出现假显性效应。异源六倍体普通小麦的染色体数目为２n＝42。减数分裂的产物中只有，n＝21和n－１＝20的大孢子能发育成有生活力的卵细胞。这种n－１的细胞中缺失的１条染色体可以是21条染色体中的任何一条。这样用单倍体母体与正常小麦杂交，在杂交后代中就可能出现各种不同的单体，这些单体各有特定的性状，其染色体数目虽不是整倍数，但仍能繁殖，因此是育种的一种方法。8.2.2染色体结构的改变染色体结构的改变起因于染色体断裂，随后以不正常的组合方式重接，从而导致产生各种结构异常的染色体。在自然条件下，染色体发生断裂的频率是很低的；但电离辐射、化学物质和病毒等因素可以明显提高染色体断裂的频率。这些可诱发染色体断裂的因子，统称为诱裂剂（clastogen）。染色体结构改变或称染色体畸变（chromosomeaberration），分为稳定畸变和不稳定畸变两大类。稳定畸变可通过细胞分裂稳定遗传，继续保留在子细胞中；不稳定畸变则会在细胞分裂过程中丢失。稳定畸变的类型有多种，包括缺失、重复、倒位、易位、插入和等臂染色体等。不稳定畸变则包括双着丝粒染色体、断片和环状染色体等。当倒位、易位等稳定畸变通过生殖细胞传递给子代时，就出现家族性染色体畸变。缺失缺失（deletion）指染色体的部分丢失。按照染色体上缺失的位置可分为末端（或顶端）缺失和中间缺失。末端缺失是染色体一次断裂，中间缺失则是二次断裂并伴有染色体断端重接。缺失片段如不含着丝粒的称为无着丝粒断片（fragment），将在随后的细胞有丝分裂过程中丢失。具缺失畸变染色体的个体，由于缺少了原来载在缺失区段上的那些基因，有害于生物体的生长和发育。缺失片段小时，可能会造成假显性现象。缺失纯合体通常难以存活，缺失杂合体的生活力很差。含缺失染色体的配子体一般是败育的，花粉尤其如此。含缺失染色体的花粉即使可育，在授粉和受精过程中也竞争不过正常雄配子。缺失纯合体在减数分裂时能正常联会和分离，二价体在偶线期和粗线期无特殊的构型出现。末端缺失杂合体减数分裂联会时，正常染色体某一区段因缺少同源区段不能联会。中间缺失杂合体在联会时，二价体会形成环或瘤，这是正常染色体未缺失区段向外突出引起的，这种情形可借助显微镜来观察。但二价体出现环或瘤时，还须参考染色体的长度、着丝粒位置、染色粒和染色节的正常分布等加以鉴定。细胞学鉴定微小的中间和末端缺失是很困难的。此外，环状（ring）染色体是一种特殊类型的染色体缺失。当一条染色体的长臂和短臂各发生一次断裂，两个断裂相互连接就会形成有着丝粒的环状染色体。重复重复（duplication）是指染色体的某一区段有额外的重复拷贝。重复是比缺失更为常见的染色体畸变，对个体造成的损害一般小于缺失。根据染色体带型分析，可以分辨出正向重复，即重复的区段与原先的取向一致；或反向重复，即重复的区段与原先的取向正好相反。重复除了发生在染色体的某一区段外，也可出现染色体组的重复，这是因为染色体复制后细胞质不分离而形成四倍体细胞。这种情况称为细胞核内复制（endoreduplication）。重复扰乱了基因间固有的平衡关系，并可引起基因作用的剂量效应（dosageeffect），使重复区段所载的相关基因表达量增加，从而引起对应的表型得到加强。重复和缺失可以是起因于染色体的不等交换（unequalcrossingover）。这是当一条染色体上的相邻区段内有相似的ＤＮＡ序列时，两条同源染色体未能正确地配对，在错配区发生了染色体交换（crossingover），结果是一条染色体上出现重复，另一条染色体上出现缺失，分别进入两个配子。可用检查缺失的方法来检查重复染色体。若重复区段较长，重复杂合体联会时，重复区段被排挤出来，也形成环或瘤，与缺失相似，但与正常染色体的长度不同。若重复区段很短，联会时重复区段可能收缩一点，正常染色体在相对区段可能伸长一点，二价体不会有明显的环或瘤。倒位倒位（inversion）是由于同一条染色体上发生了两次断裂，产生的断片颠倒180°后重新连接造成的。如果倒位发生在染色体的一条臂上，称为臂内倒位（paracentric）；如果倒位包含着丝粒区，则称为臂间倒位（pericentric）。臂内倒位不改变两个臂的长度，要用染色体显带技术才能识别；臂间倒位则使两个臂的长度出现增减，即使未作染色体显带技术处理也可观察区分。在减数分裂中，正常染色体同倒位染色体之间发生交叉互换，会使配子染色体上某一区段缺失或重复，从而造成染色体异常，导致子代出现异常性状。这是因为倒位杂合子在减数分裂时，两条同源染色体不能以直线形式配对，一定要形成一个圆圈才能完成同源部分的配对，这个圆圈称为倒位环（或倒位圈，iriversionloop，图8.2.1）。一个倒位杂合体如果着丝粒在倒位环的外面，由在减数分裂后期会出现“断片和桥”的现象，即一条染色单体的两端都有一个着丝粒，成为跨越两端的“桥”，同时伴随一个没有着丝粒的断片。“桥”在染色体移向两极进入子细胞时被拉断，造成很大缺失；断片则不能进入细胞的核内，由此形成的配子往往是死亡的。一个倒位杂合体如果着丝粒在倒位环的里面，在环内发生交换后，虽然不会出现“桥”和断片，但也会使交换后的染色单体带有缺失或重复，形成不平衡配子。这种配子一般也没有生活力。在倒位杂合子的倒位环内发生单线一次交换的产物不能形成有功能的配子。如在倒位环内发生两线双交换，最终并没有缺失和重复，因而是正常的。这样，倒位看似可以抑制倒位环内的基因发生重组，其实这只是由于单线一次重组的产物是不能存活的。利用倒位的交换抑制效应，可以保存带有致死基因的生物品系。试验用品系一般都是以纯合子形式保存，因为这是真实遗传的，但致死品系只能以杂合子形式保存下来，原因在于纯合是致死的。易位易位（translocation）主要有两种类型：相互（reciprocal）易位和罗伯逊（Robertsonian）易位。相互易位是两条非同源染色体之间互换一个区段，即两条染色体同时发生断裂，断下的区段相互交换重接。如果在断裂重接过程中，没有丢失染色体片段，称为平衡易位。平衡易位一般不产生表型效应，但会产生染色体不平衡的子代。罗伯逊易位是在两个端着丝粒染色体之间发生的。当两个端着丝粒染色体在着丝粒区发生断裂后，往往会丢失异染色质的短臂，而长臂则在着丝粒区相互重接。因此，平衡的罗伯逊易位个体所携带染色体数目少一条。相互易位的染色体在细胞减数分裂同源染色体配对时，会出现十字型图像，并将产生染色体不平衡的配子和异常的子代（图8.2.2）。染色体易位的结果也改变了原来基因间的连锁关系，使本来在不同染色体上的基因由色体易位而处在相互邻接的位置上，特别是染色体断端和重接位置上的基因，这种易位会产生明显的表型效应。罗伯逊易位有时也称罗伯逊融合（Robertsonianfusion），即两条非同源的端着丝粒染色体融合为一条染色体。当一条染色体分裂为两条染色体时，称为罗伯逊裂解（Robertsonianfission，图８.2.3）。融合和裂解改变了染色体数目，但是一般不增加或减少基因数目。染色体融合比染色体裂解更常见。从生物进化观点看，以第一个提出“融合是减少染色体数目的一种机制”的罗伯逊的名字命名的罗伯逊变化是普通现象。8.2.3基因突变和表观遗传变异生物体可以在两个水平上发生遗传变化，一种是8.2.1和8.2.2中提到的染色体畸变，是一般可在光学显微镜的分辨范围内观察到的染色体结构的改变；另一种是基因突变，这是发生在基因结构中的变化，通常无法用显微镜直接观察，而只能通过化学反应测得。基因突变是指基因的一种等位形式变成另一种等位形式，突变是相对于正常而言的。在遗传学研究中，将自然界中普遍出现的性状或指定试验用的某一品系的性状，作为“野生型”或“正常”的性状。与这种性状相关的等位基因称为野生型等位基因，一般记为＋，或a＋、B＋等。任何不同于野生型等位基因的称为突变型等位基因。从野生型变为突变型，称为正向突变（forwardmutation）；反之，从突变型也可变回野生型，则称为回复突变（backmutation）或逆向突变（reversemutation）。基因突变可分自发突变（spontaneousmutation）和诱发突变（inducedmutation）。自发突变指在自然状态下基因发生的突变。自发突变的产生并不是没有原因的，自然界的各种辐射、环境中的化学物质、生物体内的ＤＮＡ复制错误、ＤＮＡ自发损伤和修复能力的缺陷、转座因子的作用等，均可引起基因自发突变。上述这些理化生物因素，按照人为设计的条件，采用试验的手段，同样也可使基因发生突变。通过这样的方式产生的突变称为诱发突变。所有能诱发基因突变的因子，称为诱变剂（mutagen）。由于癌的发生也同基因突变密切相关，因此诱变剂往往同时也具有致癌作用，也是一种致癌物。自发突变的频率是很低的，可用突变率（mutationrate）来表示。突变率指在一个世代中或其他规定的单位时间内一个细胞发生某一突变事件的概率。在有性生殖的生物中，突变率通常用一定数目配子中的突变型配子数来表示；在无性生殖的细菌中，则用一定数目的细菌在二次分裂过程中发生突变的次数来表示。例如，高等生物的自发突变率为（１×10－10）～（１×10－５），即在10万到100亿个配子中可能有１个突变发生。不同的生物有不同的突变率；同一生物的不同基因也有不同的突变率。基因的突变是不定向的，即突变量随机的，也就是说，突变的效应并不对应于诱变因子的性质。例如，低温并不引起耐寒的突变。可是，在低温条件下，的确可以找到抗寒的作物，这是为什么呢？其实，低温在这里只是一种选择因子。在自然界的生物群体中，每一个体对温度的耐受程度本来彼此间就是不同的，这也是生物多样性的一种体现。在正常温度的环境中，耐低温的性状无从表现出来，也就无法检测出来。可是，当温度降低时，不耐低温或耐受程度较差的个体被淘汰，只有耐低温的个体被选择出来，生存下来，并逐渐成为群体中的主体，于是出现了耐低温的生物群体。可见，突变是不定向的，只有选择是定向的；群体基因型的定向变异是由选择作用造成的，而不是个体的定向变异造成的。基因突变既可以由编码序列中的核苷酸发生改变引起，也可由启动子区、剪接部位、内含子和多腺苷酸化位置上的核苷酸发生改变引起。基因突变是生物群体中遗传变异的主要来源；也是生物进化过程中自然选择的作用对象，因而是生物进化的原材料。可是对于发生突变的生物体而言，突变大多是有害的，它破坏了生物与生存环境之间长期形成的一种平衡和适应，因此危及生物体的生存。表观遗传（epigeneticｅ）变异则是另一类遗传性变化。它是指不改变基因ＤＮＡ的核苷酸序列，而使基因表达发生可遗传的改变。基因表达的改变，同样也导致与此基因相关的性状发生改变。点突变和移码突变（１）点突变单碱基对置换（singlebase-pairsubstitution）也称点变（pointmutation）。置换的方式有两种，一种是转换（transition），即一种嘌呤置换另一种嘌呤（），或一种嘧啶置换另一种嘧啶（）。另一种是颠换（transversion），即嘌呤和）嘧啶之间的互换。转换比颠换更为常见。转换和颠换如发生在基因的蛋白质编码序列中，根据基因转录和翻译产生的蛋白质可以把点突出分成以下３种：①同义突变（same-sensemutation）基因的蛋白质编码序列中发生单个碱基对的置换突变，但没有改变最后产生的蛋白质的结构，这类突变称为同义突变或中性突变（neutralmutation）。产生中性突变的原因有两个：一是点突变发生在密码子的第３个核苷酸，由遗传密码的简并性，这个突变后的密码子恰恰同突变前密码子编码同一种氨基酸，这样，突变不会改变蛋白质中氨基酸的序列；二是点突变虽然改变了所编码的氨基酸，但是并不影响蛋白质产物原来的活性和功能，如许多同工酶（isozyme）的氨基酸组成虽有差别，但功能却是相同的。因此中性突变不改变原来的表型。②错义突变（missensemutation）这种点突变后，单碱基对置换形成新的密码子，编码另一种氨基酸，最终产生另一种蛋白质，就有可能影响、改变或丢失原有蛋白质产物的功能或获得新的功能。这种点突变大多数发生在密码子第1个或第２个核苷酸。③无义突变（nonsensemutation）一个编码氨基酸的密码子在点突变后成为一个终止密码子，使多肽合成提前中止，产生缺失原有羧基端片段的缩短的肽链。在多数情况下，截短的蛋白质片段往往是没有活性的。（２）移码突变基因的编码序列中发生核苷酸增加或缺失的突变，使处在突变发生位置下游的密码子的组成发生改变，从而造成移码突变（frameshiftmutation，图8.2.4）。移码突变将合成错误的且往往是没有生物学活性的蛋白质，或是形成终止密码子，使肽链合成提前中止。点突变通常可以通过回复突变而恢复其野生型的ＤＮＡ序列。由于插入了核苷酸而引起的移码突变，也可能通过缺失而恢复到原来的ＤＮＡ序列。但如果是由于缺失而引起的移码突变，则一般是不可能出现回复突变的。当插入或缺失连续排列的核苷酸数目是３的整倍数时，其结果是密码子的插入或缺失突变，而不引起移码突变。这种整码插入或整码缺失称为整码突变（inflamemutation）。移码突变同置换突变一样都有突变热点（hotspot），即容易发生这些突变的位点。一些研究结果指出，核苷酸序列的重复是造成移码突变的原因；或者是重复的核苷酸序列的缺失造成移码突变。表观遗传变异表观遗传变异是指在基因的ＤＮＡ序列不发生改变的情况下，基因表达时发生可遗传的变化，造成基因产物的改变，导致表型变化。已发现的表观遗传变异有甲基化（methylation）、基因组印记（genomicimprinting）、ＲＮＡ编辑（ＲＮＡedition）等。这种遗传变异不符合孟德尔遗传规律。（１）甲基化在甲基化酶（methylase）作用下，将一个甲基添加在ＤＮＡ分子的碱基上，最常见的是加在胞嘧啶上，形成５－甲基胞嘧啶，用ｍC表示。在大肠杆菌（Escherichiacoli）的研究中发现，含５－甲基胞嘧啶的位置常成为自发点突变的热点，出现Ｇ·Ｃ转换成Ａ·Ｔ的突变。５－甲基胞嘧啶会以相当高的频率自发产生脱氨作用，用酮基取代氨基，使其转变成胸腺嘧啶。ＤＮＡ甲基化与基因转录活性密切相关。在原核生物中，甲基化与非甲基化基因的转录活性相差103倍；而在真核细胞中，特别是高等生物体内的甲基化与非甲基化基因的转录活性相关可达106倍。甲基化特征的遗传是通过保持甲基化酶来实现的。高度甲基化的基因处于失活状态。为细胞存活所需而一直处于活性转录状态的持家基因（housekeepinggene）则始终保持低水平的甲基化。在生物发育的某阶段或细胞分化的某种状态下，原先处于甲基化状态的基因也可被诱导除去甲基化而出现转录活性。（２）基因组印记孟德尔遗传规律认为遗传物质无论来自双亲哪一方，都具有相同的表型效应，等位基因不会因为位于不同亲代来源的染色体上而产生不同的效应。20世纪50年代末，发现果蝇的白眼基因座的一些等位基因在子代中有不同的表达，这取决于该等位基因来自父本还是来自于母本。小鼠核移植试验证明，雌、雄个体的基因组对胚胎发育的作用有所不同。例如，由两个雄原核生成的合子能发育成正常的胚外组织（extraembryonictissue），但胚胎发育很差；由两个雌原核生成的合子能发育成正常的胚胎，但不能生成胚外结构。该结果表明卵核和精核有许多自身特有的功能。这些发现指出，有些基因的功能受到雌、雄双亲基因组的影响，是打上了基因组印记的。打上基因组印记的基因如处于失活状态，称为印记失活（imprintingoff）。如母本染色体基因印记失活，则父本染色体上的等位基因得到表达；反之亦然。基因组印记过程是从配子形成时开始的。某一个体表现出上一代遗传下来的基因组印记的效应，但当该个体产生自身的配子时，上一代的基因组印记将被消除，而打上自身的基因组印记。产生基因组印记与ＤＮＡ甲基化和染色质结构变化有关。印记失活的基因通常是高度甲基化，表达的等位基因则是低甲基化。另外，染色质压缩包装成染色体时的多种因素，也可能影响到被包装在染色质结构中的基因进入转录状态。（３）ＲＮＡ编辑基因转录产生的ｍＲＮＡ分子中，由于核苷酸的缺失、插入或置换，基因转录物的序列不与基因编码序列互补，使翻译生成的蛋白质氨基酸组成不同于基因序列中的编码信息，这种现象称为ＲＮＡ编辑。ＲＮＡ编辑同基因的选择剪接或可变剪接（alternativesplicing）一样，使一个基因序列有可能产生几种不同的蛋白质，这可能是生物在长期进化过程中形成的更经济有效地扩展原有遗传信息的机制。ＲＮＡ编辑过程涉及许多酶促反应，但其机制仍不十分清楚。8.3辐射育种8.3.1辐射诱变源的种类及特性植物诱变育种中，目前常用的射线种类有：Ｘ线、γ射线、紫外线、β粒子和中子。其中除紫外线外，各种辐射通过有机体时，都能直接或间接地产生电离现象，故称为电离辐射，紫外线辐射的能量不足以使原子电离，只能产生激发作用，称非电离辐射。各种辐射由于其物理性质不同，对生物有机体的作用不一，又有其特殊性。因此，在应用时应当注意辐射的不同特性，选用合适的辐射种类。现将各种射线的性质列于表8.3.1供参考。用于辐射育种的射线种类辐射源及其特性续表：（１）放射性强度放射性强度也称放射性活度，它是表示放射性核素特征的一个物理量。处在特定能态的一定量放射性核素的强度（A）是ｄN除以ｄt的商。ｄN是在时间间隔ｄt内，由核能态发生自发跃迁数的期望值，即：辐射剂量的测量放射性强度的国际制单位（ＳＩ）是贝可（Ｂｑ）。１Ｂq表示放射性核素在１ｓ发生１次核跃迁。放射性强度的单位除“贝可”外，还有与ＳＩ并用的专用单位是居里（Ｃｉ）衰变。例如，１Ｃｉ＝3.7×1010Bp。居里表示一个放射源在单位时间内有多少个原子衰变。例如，１Ｃｉ＝3.7×1010核衰变/ｓ；１ｍＣｉ（毫居里）＝3.7×10７核衰变/ｓ；１μＣｉ（微居里）＝3.7×104核衰变/ｓ。在辐射育种中，有时用β射线照射作物，并且多数采用内照射方式，一般是经引入植物体内的放射性同位素强度表示其剂量的大小，如每粒种子引入32Ｐ10μＣｉ／粒，或每粒种子引入35Ｓ10μＣｉ／粒等。（２）照射量照射量（X）是Ｘ线和γ射线在单位质量空气中相互作用而释放出来的所有次级电子，当它们能完全被阻止在空气中时，在空气中产生同一种符号离子的总电荷量ｄQ，即照射量是表示X线和γ射线在空气中产生电离大小的物理量，定义为ｄQ除以物质的质量（ｄm）而得的商：由于照射量的基准量中存在某些困难，因此只能用于能量为10keＶ到３MeV范围的Ｘ线或γ射线。照射量的ＳＩ为库（伦）每千克（Ｃ／ｋｇ）。与它暂时并用的专用单位是伦琴（Ｒ）。伦琴的定义是１ｇ空气被Ｘ线或γ射线所照射，当其所吸收的能量为83erg（尔格）时，这１ｇ空气所受到的照射（Ｘ线或γ射线）量就是１Ｒ。单位时间内照射量的增量为照射量率（Xｒ）。若在时间间隔ｄt内照射量为ｄX，则：照射量率的ＳＩ是库（伦）每千克每秒（Ｃ·ｋｇ－１

·ｓ－１）。它与专用单位伦琴每秒（Ｒ／ｓ）暂时并用。（３）吸收剂量辐射的生物效应与吸收剂量的关系，要比与照射量的关系更为密切。辐射对物质的作用过程，实质上是能量转移和传递的过程。例如，射线作用于种子，其能量就被种子吸收。所谓吸收剂量（D）即授予单位质量物质（或被单位质量物质吸收）的任何致电离辐射的平均能量，定义为致电离辐射授予某一体积元中物质的平均能量（ｄε，ｅｒｇ）除以该体积元中物质的质量（ｄm，g）而得的商：吸收剂量的ＳＩ是焦耳每千克（Ｊ/ｋｇ），吸收剂量的专用单位是戈瑞（Ｇｙ）。戈瑞是吸收剂量的国际单位制，定义为每１ｋｇ任何物质吸收任何电离辐射的能量为１Ｊ时的吸收剂量。１ｇ被照射物质吸收的辐射能量为100ｅｒｇ的剂量叫作１ｒａｄ（拉德）。所以有：单位时间内吸收剂量的增量为吸收剂量率（Dｒ）。若在时间间隔ｄt内吸收剂量ｄD，则：吸收剂量的ＳＩ是焦耳每千克每秒Ｊ·ｋｇ－１

·ｓ－１，吸收剂量的专用单位是戈瑞每秒（Ｇｙ／ｓ）。它与专业单位拉德每秒（ｒａｄ／ｓ）暂时并用。（４）积分流量采用中子照射作物，其剂量有的用拉德（ｒａｄ）表示，有的则以在某一中子“积分流量”之下照射多长时间表示。所谓“积分流量”是指每ｃｍ２截面积上，通过的中子总数（中子数／ｃｍ２）。8.3.2辐射诱变的作用机制（１）物理阶段各种射线穿透生物体时，将发生一系列的物理作用，其最大效应是辐射的射线能量转移，并由此产生电离作用。电离的行为可能发生在染色体内部或其四周的细胞核与细胞质的原子或分子中。

电离辐射的作用过程放射性物质放射出来的带电粒子（如β射线）与生物大分子或原子发生非弹性碰撞，使原子中的束缚电子产生加速运动，获得足够能量而变成自由电子。这样就产生了自由电子和正离子的离子对，称为直接电离。如果束缚电子所获得的能量还不足以使它变成自由电子，而只激发它到更高的能级，则称为激发作用。此外，入射粒子在物质中由于直接碰撞，打出能量较高的电子，然后该电子再按上述过程产生离子对，称为次级电离。不带电的入射粒子（如γ射线）通过植物体时可产生次级电离。入射粒子在植物体中通过时，单位路径产生的离子对数目为电离密度。它取决于粒子的速度和所带电荷。电荷越多，则粒子与电子间相互作用越强，电离密度也越大；粒子速度越低，它位于电子附近的时间越长，相互作用越有效。如γ射线，其粒子穿透植物体时，在一个生物大分子中可能只形成很少几个离子对，其电离密度小，分子受损害较小；反之，热中子在射程的单位长度内产生很多离子对，大分子受到很多次电离，其电离密度大，分子受损害较多。Ｘ线和γ射线都是一种光子，对于物质的主要作用有光电吸收、康普顿散射和电子对的形成等。当一个低能量光子和原子相碰撞时，可能将其所有的能量传给一个电子，使它脱离原子而运动，光子本身则整个被吸收。由于这种作用而释放出来的电子称为光电子，这种效应称为光电吸收。光电子和普通电子一样，在物质运动时与相遇的原子产生电离。当中等能量的光子与原子中的一个电子发生弹性碰撞时，光子交出自己一部分能量传给电子，原子内的电子得到能量后就离开原子，称为康普顿散射。康普顿电子（得到能量的电子）由于能量大大增强，在穿过物质时能引起电离。同时，光子继续朝着其原来的方向成某种角度散射开去，称散射光子。散射光子根据本身存在的能量值，再次与其他原子中的电子发生弹性碰撞，同样产生新的康普顿散射或光电吸收。当高能量光子与物质相互作用，则会产生一对正负电子，光子本身整个消失，称为电子对的生成。电子与正电子的功能一般是不相同的，可以有不同的组合。电子可使介质中的原子电离并消耗其全部能量，当正电子损失其全部功能后，将与中子结合转化成光子，称为光化辐射。由于中子不带电，所以能自由地穿入原子核引起核反应。当它作用于生物体时不产生直接电离作用，而是通过冲击原子核产生核反应，放出各种射线引起电离。中子与核发生弹性碰撞时，可将部分能量转移给原子核而使该原子电离，变成快速的带电离子（反冲质子）。这样的带电离子具有与上述带电粒子相同的性质和作用。中子本身则由于多次碰撞而逐渐慢化，被称为热中子。快中子、慢中子或热中子引起核反应可以产生放射性物质、γ射线或其他粒子。如慢中子不击出质子来，却被其通过的物质的原子核所捕获，则产生一个可放射出γ射线的新原子核。中子穿过物质所产生的各种射线同样发生光电吸收、康普顿散射和电子对的生成等。中子照射植物的效应，基本上是依赖于质子和γ射线的电离作用。（２）化学阶段离子对的形成标志着辐射的直接物理作用的结束以及化学作用的开始。由于活的植物组织中７５％是水，因此水就成为电离辐射最丰富的靶分子。水中的１个离子对的形成叫做射解作用，可用下列反应式表示：从水脱离出来的自由电子又可与１个正常的水分子反应形成离子Ｈ２Ｏ－：上述两种水离子Ｈ2Ｏ＋和Ｈ２Ｏ－与水分子进一步起反应形成离子和自由基，其反应式如下：Ｈ＋和ＯＨ－是不稳定的离子，并重新化合成水；但Ｈ·

和ＯＨ·等自由基非常活跃，很容易与其他分子起化学反应。这些反应总称为辐射的间接作用。在水中许多自由基相互反应，反应式如下：上述最后一个反应的产物过氧化氢是一种活泼的氧化剂，对生物系统关系重大。但更为重要的是Ｈ·和ＯＨ·，这些自由基能与溶质分子起反应，细胞中的这些溶质分子可以影响细胞以后的生活力。特别是在有氧的情况下，与氧结合成为活跃的自由基，例如：过氧基是一种寿命相当长的氧化物质，它能移到大分子的表面，使大分子发生通常有损于细胞功能的化学反应。研究认为，危害最大的自由基是氢原子、羟基和水化电子。由于这些自由基都是强还原剂或强氧化剂，可能改变植物体内正常的氧化还原过程，使糖类、蛋白质和酶等物质的代谢发生变化，破坏生物体原有的稳定性，引起一系列的生物学效应。（３）生物学阶段辐射在生物学方面的效应比物理和化学的效应所需要的时间要长得多，通常需要几个世代的时间才逐渐显示出来。辐射对细胞结构的破坏效应，首先是引起半透膜的破坏。细胞中的半透膜对细胞的功能极为重要，水分和盐类的相互关系靠它来维持，同时它又是各种细胞器（线粒体、叶绿体、溶菌酶等）的外膜。内质网膜是折叠在细胞内的网状膜，为核糖体、蛋白质体提供养分，并与它们共同合成蛋白质。辐射引起半透膜的破损，可能是由于自由基对面积甚大的膜表面作用的结果。这无疑是细胞逐渐失去活力的一个因素。从受辐射后的细胞还可以观察到细胞核显著膨大、染色体出现成团现象、核仁和染色质的空泡化、核膜的增厚、核质分解为具有（或无）空泡的染色质块等现象。在正分裂的细胞中，会观察到染色质黏合、断裂及其他结构变异（如产生巨核细胞、多核细胞等）。此外，细胞质的结构成分也会发生各种物理、化学性质的变化，如黏度的改变、空泡的形成、电解质及水分的渗透性升高等。辐射还可能使某些促进细胞新陈代谢所需要的酶“失活”，引起细胞死亡。特别是某些酶本来数量较少，却参与某些极重要的物质（如维生素和激素等）的合成，这些酶的丧失可能对细胞功能的丧失起重要作用。在细胞群体中，辐射损伤具有随机性。有些细胞受到严重的损伤而引起死亡，有些细胞仅受到轻微的损伤，还有些细胞根本没有发生电离。甚至在同一个细胞内，未受损伤的分子群有时有“接管”代谢过程并使其逐渐恢复到正常水平的能力。其结果，使复杂有机体表现出在受到亚致死剂量电离辐射的作用后还具有恢复的能力。甚至在很多情况下，受中等剂量辐射后，物质合成水平比受辐射前更高。辐射不仅对细胞造成伤害，影响细胞的功能甚至使细胞失去活力或死亡，而且对染色体、ＤＮＡ和ＲＮＡ的影响极大。由于染色体、ＤＮＡ和ＲＮＡ与遗传有密切关系，因此它们受辐射后产生的异构现象，都会导致有机体的性状变异。辐射引起ＤＮＡ氢键的断裂，使ＤＮＡ结构紊乱，使遗传信息的储存和补偿系统发生转录错误，这些错误最终导致有机体突变。辐射还会造成染色体数量的变化，包括因染色体整数倍的增减产生的多倍体和单倍体，以及染色体零星增减产生的非整倍体，如γ射线处理橡胶无性系使后代中出现２n＝45～54的个体。电离辐射的遗传效应8.3.3辐射诱变的方法（１）外照射放射性元素不进入植物体内，而是利用其射线（Ｘ线、γ射线或中子）照射植物的各个器官。它是应用最普遍、最主要的照射方法，其最大优点就是操作方便，利于集中处理大量材料，一般没有放射性污染和散射问题，所以比较安全，因此在辐射育种中应用最为广泛。外照射按处理植物的部位和方法不同，又分以下几种：照射方法①种子照射照射方法多种多样，可照射干、湿和萌动种子。此法操作简单，体积小，处理数量多，并易于储存和运输。但从播种到开花结果时间长，植株占地面积大。供照射的种子材料应预先经过精选，要求纯度较高，不含杂物。照射后应及时播种。过早进行种子照射处理，容易产生储存效应。如果照射干燥种子，并在干燥有氧条件下储存，可使损伤加剧。②花粉照射照射的方法有两种，一种先将花粉收集于容器内，经照射后立即授粉，这种方法适用于那些花粉生活力强、寿命长的植物，可与单倍体育种结合进行；另一种是直接照射植株上的花粉，这种方法一般仅限于有辐射圃或有便携式辐照仪的单位，可以进行田间照射。用辐射诱变的花粉进行受精，所得后代由于携带杂合的突变基因，便可分离出许多突变体，以供进一步筛选之用。③子房照射该法与照射花粉具有同样的优点，即不易出现嵌合体。用射线直接作用于卵细胞，对后代变异影响很大，除能引起雌性的细胞变异外，还能影响受精作用，有时可诱发孤雌生殖，产生良好的诱变效果。对自花授粉植物进行子房照射时，在照射前应进行人工去雄；对高度自交不亲和的雄性不育材料照射子房时可不必去雄，更为简便。由于卵细胞对辐射较为敏感，处理时宜采用较低剂量。④营养器官照射此法适应于无性繁殖植物（如薯类、鳞茎类及果树和部分观赏植物等）。照射的材料有块根、块茎、鳞茎、球茎、幼芽、枝条和嫁接苗等。该方法可大大提高突变频率，并且与照射花粉和种子相比具有结果早、鉴定快等特点。照射的枝芽等应选择组织健壮、芽眼饱满的芽条，照射后嫁接易于成活。解剖学的研究和分析指出，为了减少嵌合体，受处理的芽原基所包含的细胞越少越好，照射后可得到最多的突变体。经验表明，初生枝第４至第８个叶片叶腋内的芽，在下一营养繁殖世代中，出现较宽的突变扇形体的频率最高。据报道，照射苹果刚刚开始萌动的芽比深休眠芽的效果好，前者突变频率高。⑤植株照射可在植株一定发育阶段或整个生长期，在辐射场对植株进行长期照射。钴植物园（γ－field）是进行大规模田间植株照射的辐射育种设施，其优点是能同时处理大量整株材料，并能在植物整个生长期内在田间自然条件下进行长期照射。由于这种照射场辐射强度极高，故必须具有严格的安全防护设备和措施。钴源不用时借遥控自动装置将其降入地下室中。受照射植物可按所需剂量大小计算出离钴源的适宜距离，然后以钴源为中心，按照已确定的距离，呈辐射状同心圆种在其四周进行照射，靠近射线源的植物每天受到的照射剂量可高达10000Ｒ以上，随着距离的增加，剂量也相应降低。在钴植物园中处理的一年生植物，受照射达一定剂量后可栽植到无处理区，必要时也可留在钴植物园内直至结实，次年将其种子播种于无处理区。其他植物器官组织的照射其他的植物器官和组织，如叶片、愈伤组织、花药、合子以及细胞、原生质体等均可作为照射的材料，可结合植物组织培养和细胞培养进行。（２）内照射将一定量放射性同位素引入植物体内，使其所放射出的射线在植物体内进行照射，称为“内照射”。该方法需要一定防护条件，易造成污染和提高环境的放射性“本底”，而已被吸收的剂量不易精确测定，故应用受到一定限制。但内照射具有剂量低、持续时间长、大多数植物都可以在生育阶段处理等优点。进入植物体内的放射性元素，除其本身释放的放射性效果外，还要考虑到由衰变产生的新元素的“蜕变效应”。通常用作内照射的放射性同位素，主要有32Ｐ、35Ｓ、45Ｃａ（放射β射线），以及65Ｚｎ、60Ｃｏ（放射γ射线）等。内照射的方法一般有以下几种：①浸种法将放射性同位素配制成一定强度比例的溶液，对需诱变的种子或枝芽进行浸泡。为确定放射性溶液用量，使种子吸胀时能将溶液全部吸干，种子需先进行吸水量试验。放射性溶液所用剂量范围一般是0.1～10μＣｉ／粒。②施入法用放射性同位素作“超微量元素”施入土壤（如32Ｐ磷肥），植物在吸收肥料时，便可将其吸入体内。③涂抹法用放射性同位素溶液与适当的湿润剂配合，涂抹在植物体上或浸泡植物叶片、嫩梢，通过根外吸收，将放射性同位素引入植物体内。④注射法用注射器将放射性同位素溶液注入植物组织内（如嫩枝、幼芽、花蕾、块茎、鳞茎等）。⑤在示踪研究的植株上采种子或枝条例如，用32Ｐ进行肥料试验或用14Ｃ进行光合试验的植株，其体内和所结种子均接受过同位素的内照射，也可用作辐射诱变的研究材料。（３）间接照射又称培养基照射或培养液照射。用射线照射纯水、培养液或培养基，然后将萌发的种子或其他植物材料放入其中处理；亦可先照射种子或其他植物组织，在低温下提取其浸出液，再以此提取液浸渍未经照射过的种子或其他植物材料。两种方法均可引起染色体畸变，在微生物诱变育种中应用较多。（４）快照射和慢照射快照射和慢照射是根据照射剂量强度划分的，前者是在短时间内进行高剂量照射，后者是在长时间内进行低剂量缓慢照射。对剂量强度要视被处理植物（细胞）代谢活性而定。代谢活性弱（如休眠种子），无论是快照射、慢照射还是间断照射，如果总剂量相同，效果也会相同。但如果代谢活性强，则慢照射效果差，这是由于有恢复能力的原因。适宜的剂量是指能够最有效诱发育种者所希望获得的那种变异类型的照射量。确定适宜的辐射剂量是诱变处理成败的关键，同时又是一个极为复杂的问题，受多种因素的影响，应遵循一定的原则。它因作物种类、照射器官、植物生长期和所处的生理状态以及其他许多内因、外因的不同而异。适宜剂量和剂量率的确定在辐射育种中，一般随着辐射剂量增加，变异率也会增加，但致死率也随之提高。若辐射剂量超过一定限度就会导致处理材料全部死亡，这时的剂量称为“致死剂量”（LD100）。选择适宜辐射剂量的一般做法是以发芽率（或幼苗生长势）为指标，找出发芽率为对照（无处理）一半时的剂量，即照射种子或植物某一器官的成活率占50％的剂量，称“半致死剂量”（LD50），以此为中心增高或降低试验剂量。照射种子或植物某一器官成活率占40％的剂量称“临界剂量”（LD60）。实践中大多以临界剂量作为选择适宜剂量的标准，但也有人主张采用比临界剂量低的剂量，因为剂量过高不仅导致照射第１代植株的大量死亡，外因素极为复杂，而且至今尚未研究清楚，所以目前并没有公认的权威数据。现根据国内、外研究的结果，综合列于表8.3.2供参考。8.3.4辐射育种程序目前辐射处理还难以实现“定向突变”，为了提高辐射育种的效果，关键是要正确地选择辐射处理的亲本材料，才能取得理想的效果。为了实现不同的育种目标，应选用具有不同特点的亲本材料类型进行诱变处理。例如，为了选育抗病毒病（如ＴＭＶ、ＣＭＶ）的番茄优良品种，则亲本材料应该是丰产、优质、成熟期适宜，最好还能抵抗除病毒病以外的其他主要病害的品种，否则便不易达到预期的育种目的。处理材料（原始材料及处理器官）的选择为增加辐射育种成功机会，选用的处理材料应避免单一化，因为不同品种或类型，其内在遗传基础存在着差异，对辐射敏感性也不同，因而诱变的突变率和突变类型以及优良变异出现机会和优良程度等也有很大差别。所以在条件许可下，应适当多选几个亲本材料为好。如果是为了获得新变异，供作杂交亲本之用，也一定要选择综合性状优良的亲本材料进行处理。至于每个亲本材料处理的种子数量则应根据处理剂量高低、不同材料辐射敏感性强弱、有用突变率高低、人力、物力等客观条件灵活掌握，总的原则应是保证获得足够数量的成活变异植株，以便为进一步筛选有益变异提供适当的选择群体。例如，有用突变率预期为10-３，用半致死剂量处理种子，则估计需处5000～10000粒，才能期望有95％～99％的概率在处理群体内有１株有用突变个体。处理的亲本材料综合性状应优良，且只有一、两个需要改进的缺点，而不应是缺点很多、仅具有少数突出优点的材料。这主要是由辐射育种的特点所决定的。为此，通常可选用当地生产上推广的良种或育种中的高世代品系作为诱变材料。此外，也有人主张可选用具有强优势的、综合性状优良的杂种一代或有前景的杂种后代作诱变材料。适当选用单倍体、原生质体等作诱变材料，发生突变后易于识别和选择。突变一经选出，将染色体加倍后即可使突变纯化，可显著缩短育种年限。但是单倍体生活力较弱，诱变中死亡率较高，加倍较困难，繁殖系数较小，所以采用的剂量不宜过高，并应对诱变材料提供适宜的营养和环境条件。此外，也可用单细胞或原生质体作诱变材料，与细胞培养相结合，以避免正常细胞与突变细胞的竞争，从而提高突变育种的效果。有性繁殖植物种子（胚）经诱变处理后长出的植株，称为Ｍ１（突变１代）植株。Ｍ１植株通过配子受精最后形成种子即为Ｍ2（突变２代）。Ｍ2入选的突变体繁殖的后代为Ｍ3。以此类推。无性繁殖植物突变世代的划分，一般以营养繁殖的次数作为突变世代数。无性繁殖植物的亲本世代、突变世代、突变２代、突变３代，分别以ＶＭ0（或Ｍ0）、ＶＭ1（Ｍ1）、ＶＭ2（Ｍ2）…等符号表示，或简写为V0、V1、V2、V3

…等。突变世代的划分各世代群体的大小是关系到能否选择到所需突变体的重要问题。群体过小，后代的选择概率太低，不易选到所需的突变体；群体过大，耗费人力、物力，增加工作量。究竟多大的群体才合适，要根据具体作物种类及所需获得的突变类型、突变频率、突变体数目等因素决定。因此，在进行诱变育种前，对各世代群体进行一些估计是必要的。对于单基因突变，假定其突变率为u，至少要发生１个突变的概率水平为p１，则被鉴定的处理细胞数目n可从下列公式算出：分离世代群体数量的估计突变可在被辐射细胞的后代中发现，而二倍体植物存在的隐性突变在Ｍ2才能表现出来。如果辐射材料具有50％致死效应，则２n的值代表提供Ｍ2株系所需的Ｍ1植株数。每个Ｍ2株系植株数（m）是由分离比例（a）和至少能产生１个纯合突变体的概率（p２）来决定的。根据各种a及p２的值可以计算出Ｍ2各株系的应有植株数（m）：把上述两个公式合并起来，可以计算出群体的应有大小。但从实用观点看，很少能正确预测突变率，应用该公式计算的仅仅是一个粗略预测。但是，对于鉴别有实用价值的数量性状变异所需群体数目的计算是比较困难的，因为既不能确定所包括的基因数目，也不能确定在Ｍ２中加以鉴别的最低效果的数量。根据一般的突变率和突变体在后代出现概率，有人计算在自花授粉作物中，为获得１个多基因控制的数量性状突变体，在Ｍ２需要1000～5000株；获得１个带有几个隐性基因控制的复杂性状突变体，其Ｍ２需要50万株左右；获得１个单隐性基因控制的性状突变体，Ｍ２多达10万～50万株；获得１个单显性基因控制的性状突变体，Ｍ２多达１５０万株。随着诱变方法的不断完善，提高诱变育种效率的关键已不再是如何提高突变频率，而是如何以简单有效的手段检测出优良的突变体。目前在诱变育种实践中，对突变体鉴定的方法主要有以下几种：（１）形态鉴定诱变育种最常用方法，即将所获得的突变体与原品种一起种植于田间，在主要生育期目测或借助简单工具进行观察、记载和比较。很多突变性状，如熟期、株高、花数、果数、果大小等，可通过这种方法从形态上直接或间接识别。由于气候、土壤、肥料、种植密度等都会引起性状变异，从而造成不同年份间和不同材料间的性状差异，给突变体鉴定带来一定困难。迄今为止，形态鉴定还缺乏统一标准，各单位都是按照各自实际情况来鉴定突变体。突变体鉴定和选择（２）生理生化鉴定生理特性和品质突变体可借助于如蛋白质、氨基酸、糖等的含量分析来鉴定。这种鉴定工作量往往很大，可借助相应的自动化仪器来完成。同工酶是有机体内酶的多种分子形式，是基因调控表达的结果。野生型与突变型之间同工酶的差异，反映了它们之间遗传基础的差异，因而通过利用各种凝胶电泳鉴定同工酶谱异同来鉴别突变种质资源是十分有效的。但在实际工作中要注意，用于鉴定突变体的同工酶必须稳定性好，不受外界条件影响，以保证结果准确可靠。（３）分子标记鉴定详见本教材第９.４节相关内容。（４）遗传鉴定为了鉴定早熟、矮秆、抗病性等突变体的遗传特性及其在育种上的利用价值，可将突变体与原品种及其他亲本杂交、回交，确定控制突变性状的显隐性和基因数目以及该性状的遗传规律和遗传率，一般来说，遗传学鉴定要在上述形态等鉴定的基础上进行。（５）抗性突变体的离体筛选鉴定可利用诱变方法和生物离体培养技术筛选鉴定抗病、抗逆突变体。其要点是先对培养材料进行诱变处理，然后培养在添加一定浓度的病原物、病毒菌产生的致病毒素或其他胁迫因子的培养基中。正常情况下，大多数细胞由于生长受到抑制而逐渐消失，只有少数发生突变的细胞才能在这种不利环境中正常生长分化，通过连续培养后长成植株。这种方法处理群体大，有利于多种诱变剂的应用，能使突变体基因在细胞水平上表达，便于进行单细胞选择和突变体的早期筛选鉴定，可以显著提高诱变育种效率。在辐射育种中，由于有利变异出现频率很低，而且突变多为隐性，所以要准确无误地发现突变，选出有利变异是较为不易的。必须遵循细胞遗传学原理，按照一定育种程序进行工作，才能达到目的。（１）以种子为辐射处理材料者将待处理的种子按不同的辐射剂量分别播种，为Ｍ1。由于突变多属隐性，可遗传的变异在Ｍ1通常并不显现，Ｍ1所表现的变异多为高能射线所造成的生理变异（特别是生理损伤和畸形），这些变异无论优劣，一般并不遗传，因此Ｍ1不必进行选择淘汰，而应全部留种。Ｍ1植株应隔离，使其自花授粉，以免有利突变因杂交而混杂。经辐射处理的种子应在15～30天播种，不宜拖延太久。辐射育种的基本程序Ｍ2的播种及鉴定：由于照射种子所得的Ｍ1常为“嵌合体”，故对Ｍ1最好能分果或分穗时分别采收种子，然后每果（穗）分别播种成一个小区，称为“穗系区”，以利于以后计算变异频率并易于发现各种不同变异。由此可见，Ｍ2的工作量是辐射育种中最大的一代，为了获得有利突变，通常Ｍ2要有几万个植株，每一Ｍ1个体的后代（Ｍ2）种植20～50株。因为隐性突变经一代自交至Ｍ2便可显现出来，故对Ｍ2的每一个植株都要仔细观察鉴定，并且标出全部不正常的植株，对于发生了变异的果（穗）行（每行有１～５株发生突变），则从其中选出有经济价值的突变株留种。Ｍ3的播种及鉴定：将Ｍ2中各个变异植株分株采种，分别播种一个小区，称为“株系区”，以进一步分离和鉴定突变。一般在Ｍ3已可确定是否真正发生了突变，并可确定分离的数目和比例，同时可测每株产量作为突变株产量的初步概念。因为在Ｍ2中入选的植株不会很多，所以Ｍ3工作量较小。在Ｍ3中鉴定淘汰不良“株系”，在优良“株系”中再选出最优良单株。Ｍ4及Ｍ5的播种及试验：将优良Ｍ3株系中的优良单株分株播种成为Ｍ4，进一步选择优良的“株系”，如果该“株系”内各植株性状表现相当一致，便可将该系优良单株混合播种为一个小区，成为Ｍ5，至此突变已告稳定，便可与对照品种进行品种比较试验，最后选出优良品种。（２）以花粉为辐射材料者由于花粉的生殖核可以认为是一个细胞，所以当辐射处理后，如果花粉产生突变，就是整个细胞发生了变异，用它授粉所得的后代整个植株便可带有这种变异，不会出现遗传上的嵌合体，故当用Ｍ1的种子播种Ｍ2时，不必分穗（果）播种，只要以植株为单位分别播种为株系区即可，每一个Ｍ2系种植10～16株，其他程序同上。（３）以营养器官为辐射对象者无性繁殖材料多为异质，因此辐射处理后发生的变异在当代就可表现出来，所以后代选择可从Ｍ1进行。同一营养器官（如枝条）的不同芽对辐射的敏感性及反应不同，可能产生不同变异，故辐射后同一枝条上的芽要分别编号、分别繁殖，以后分别观察其变异情况，如果发现有利突变，便可用无性繁殖法使之固定成为新品种。在无性繁殖下不会产生分离，故果树、薯类及某些观赏植物等无性繁殖植物的辐射育种程序极为简单。但是，无性繁殖植物经诱变处理后，突变细胞和其他细胞会发生竞争。由于突变细胞开始有丝分裂时受到抑制和延迟，因而不易表现出来。应采取一些人工措施，创造有利于变异体细胞生长发育的条件，促使它增殖，如多次摘心、修剪等。8.4化学诱变育种化学诱变剂（chemicalmutagens）是指那些能与生物体的ＤＮＡ发生化学反应，使后代产生变异的化学物质。化学诱变育种是指采用化学诱变剂处理一定的植物材料，以诱发植物遗传物质的突变，进而引起植物特征、特性的变异，然后根据育种目标，对这些变异进行鉴定、培育和选择，最后育成新品种的育种途径。与辐射诱变比较，化学诱变主要有以下特点：（１）使用经济方便化学诱变处理只需要少量药剂和简易设备即可开展工作。当没有Ｘ光机或更昂贵的γ（或其他）射线源而不能进行辐射育种时，仍可借助化学诱变方法进行诱变。

8.4.1化学诱变的特点（２）具有一定的专一性已经发现不同药剂对不同植物、组织或细胞，甚至对染色体节段或基因的诱变作用具有一定的专一性。如马来酰肼对蚕豆第Ⅲ染色体第14段特别起作用；而乙醇则对其第Ⅳ染色体第19段的作用特别有效，都能诱发很多染色体的畸变。在同一条件下，不同基因的突变频率有时相差几百倍。资料表明，在某种化学诱变剂作用下，可优先获得一定位点的突变。如盐酸肼处理番茄较盐酸胲能获得更多矮生突变。不同诱变剂的这种“特殊”功能，看来比辐射要明显一些。不过在实际应用中尚未完全解决，但这有可能是解决定向突变的一条途径。（３）化学诱变与辐射诱变的突变谱很不相同许多作者指出，用辐射处理大麦（特别是用快中子处理后）所产生的绿叶突变谱较窄，而且大多是白化突变类型；用化学诱变剂处理则能产生较宽的突变谱，其中白化突变的百分率显著下降。此外，用化学诱变剂ＥＩ处理，较γ射线处理可提高下一代育性达３倍多。（４）诱变机制不同辐射诱变是由射线的高能量造成的，而化学诱变剂则是由其化学特性与遗传物质发生一系列生化反应造成的；辐射处理的特点是能够获得广泛的染色体结构突变谱，而化学诱变剂造成的突变则更多的是基因点突变。由于化学诱变剂能诱发更多的“点突变”，而几乎不产生染色体畸变，所以化学诱变剂更为适用。射线对ＤＮＡ或染色体的作用一般是在照射时发生的；而化学诱变剂的作用则是在较晚时期发生的，即所谓“迟发突变”。此外，不同个体、组织或细胞对射线和化学诱变剂的敏感期也有显著的差异。（１）烷化剂这类诱变剂是在诱变育种中应用最广泛的一类化合物。它带有１个或多个活跃烷基，这些烷基能转移到其他电子密度较高的分子（亲和中心）中，通过烷基置换取代其他分子的氢原子，称为“烷化作用”。它们借助于磷酸基、嘌呤基、嘧啶基的烷化而与ＤＮＡ或ＲＮＡ起作用，进而导致“遗传密码”改变。碱基经常发生的改变是形成７-烷基鸟嘌呤。烷化剂的又分为以下几类：①芥子气类芥子气类的化学药品主要有氮芥类和硫芥类两类。8.4.2化学诱变剂的种类、特性和诱变机制氮芥类：通常为盐酸化合物，种类很多。有三（2-氯乙基）胺（氮芥B）［N（CH2CH2CL）3］，（2-氯乙基）甲基胺（氮芥Ａ）［CH3Ｎ（CH2CH2CL）］，双（2-氯乙基）胺［ＨＮ（CH2CH2CL）2］，双（2-氯乙基）甲胺氧化物［CH3ＮＯ（CH2CH2CL）2］，２-氯乙基双甲基胺［（CH3）2ＮCH2CH2CL］等。硫芥类：有芥子气［S（CLCH2CH2）2

］、氯乙基·乙硫醚（CH3CH3SCH2CH2CL）、硫芥Ｃ［Ｏ（CH2CH2ＳCH2CH2CL）２］等。

这类药剂均属于烷化剂，它们都有１、2或３个活性基（活跃的烷基）。据认为其诱变机制是引起染色体畸变。如硫芥的产物能在ＤＮＡ双螺旋的两条链之间形成交联而阻止ＤＮＡ两条链的解离，妨碍复制的进行，造成遗传变异。②次乙亚胺和环氧乙烷类这类化合物诱变作用很大，主要有次乙亚胺（乙烯亚胺）、乙酰乙烯亚胺、环氧乙烷、环氧丙烷、１，2-环氧丁烷、3，4-环氧丁烷等几种。这些药剂也是一类烷化剂。研究认为，它们会产生遗传效应是由于这些药剂可使ＤＮＡ磷酸基起烷化作用，其反应生成物是极不稳定的，迅速水解成磷酸酯和脱氧核糖，造成ＤＮＡ链断裂。这类药剂也可与嘌呤或嘧啶起烷化作用，造成脱氧核糖和碱基之间的链断裂。失去碱基的ＤＮＡ不稳定，又可造成脱氧核糖和磷酸链的断裂，进而引起ＤＮＡ链的断裂。③烷基磺酸盐和烷基硫酸盐类这是一类具有很强诱导变性能力的重要烷化剂，是一类烷基化合物。如乙基磺酸甲烷（ＥＭＳ）、乙基磺酸乙烷（ＥＥＳ）、甲基磺酸甲烷（ＭＭＳ）、丙基磺酸丙烷（ＰＰＳ）、甲基磺酸丙烷（ＰＭＳ）、甲基磺酸丁烷（ＢＭＳ）等。与这类烷基磺酸盐类作用相似的有另一类磺基硫酸类化合物，如硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、硫酸二甲酯（ＤＭＳ）、硫酸甲乙酯（ＭＥＳ）等。它们的诱变机制与上述烷化剂相似，主要是它们的活性功能与“遗传物质”起烷化作用，从而造成ＤＮＡ复制时的紊乱以及ＤＮＡ链断裂或染色体交联等。例如，甲