T-SATA 079-2024 果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺含量测定 高效液相色谱-串联质谱法

ICS03.080.99CCSX00DeterminationofasparagineandglutamineinfruitsandvegetablesbyLC-MS/MSIT/SATA079—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4原理 5试剂与材料 6仪器和设备 27分析步骤 28结果计算 49灵敏度、精密度 4附录A（资料性）天冬酰胺和谷氨酰胺标准溶液及其内标的液相色谱-串联质谱图 6T/SATA079—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由深圳市计量质量检测研究院提出。本文件由深圳市分析测试协会归口。本文件起草单位：深圳市计量质量检测研究院、深圳市农产品质量安全检验检测中心、深圳深检集团医学检验实验室。本文件主要起草人：肖伟敏、叶新玉、王奇、孙亮、李子樱、杨国武、赵云霞、唐淑军、孙丽萍、刘成文、陈欣、张玉鑫、黄城益、颜沁、朱泽超、林伟杰、孙胜男。1T/SATA079—2024果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺含量测定高效液相色谱-串联质谱法本文件规定了果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于新鲜果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T32465-2015化学分析方法验证确认和内部质量控制要求3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样经灰色链霉菌蛋白酶酶解，并加入抗氧化剂丁基羟基苯甲醚处理，稀释后用液相色谱-串联质谱法测定，同位素内标法定量。5试剂与材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。5.1试剂5.1.1甲醇（CH3OH）：质谱纯。5.1.2甲酸（CH2O2）：色谱纯。5.1.3乙醇（CH3CH2OH）：分析纯。5.1.4浓盐酸（HCl）。5.1.5丁基羟基苯甲醚（C11H16O2，BHA）。5.1.6灰色链霉菌蛋白酶（XIV型；来源于灰色链霉菌）：酶活力≥3.5U/mg。5.1.7三羟甲基氨基甲烷（Tris碱，C4H11O3N）。5.2试剂配制5.2.10.02%甲酸水溶液：吸取0.2mL甲酸至1L容量瓶中，定容至刻度，混匀。临用前配置。5.2.2丁基羟基苯甲醚溶液（40mg/mL）：称取4.00gBHA，用乙醇溶解并转移至100mL容量瓶中，定容至刻度。临用前配置。5.2.3蛋白酶溶液（52.5U/mL称取0.15g灰色链霉菌蛋白酶，用Tris缓冲液溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度。临用前配置。5.2.4盐酸溶液（1.0mol/L）：移取8.3mL浓盐酸至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。常温保存，2T/SATA079—2024有效期1个月。5.2.5Tris缓冲液（0.05mol/L称取6.06g三羟甲基氨基甲烷于1000mL烧杯中，加水800mL溶解，用1.0mol/L盐酸溶液调节溶液pH至8.0±0.1，转移至1L容量瓶中，用水定容至刻度。4℃保存，有效期1个月。5.3标准品5.3.1天冬酰胺标准品（C4H8N2O3，CAS号：70-47-3）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.2谷氨酰胺标准品（C5H10N2O3，CAS号：56-85-9）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.3天冬酰胺同位素内标（天冬酰胺水合物-15N2，C4H815N2O3·H2O，CAS：287484-32-6）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3.4谷氨酰胺同位素内标（谷氨酰胺-15N2，C5H1015N2O3，CAS：204451-48-9）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.4标准溶液配制5.4.1天冬酰胺标准储备液（2.00mg/mL）：准确称取100mg（精确至0.0001g）天冬酰胺标准品，用20%甲醇溶液溶解并转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3个月。5.4.2谷氨酰胺标准储备液（2.00mg/mL）：准确称取100mg（精确至0.0001g）谷氨酰胺标准品，用20%甲醇溶液溶解并转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3个月。5.4.3外标混合标准中间液（20.0μg/mL）：分别移取标准储备液各1.00mL至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。临用前配置。5.4.4外标混合标准工作液（1.00μg/mL）：移取0.50mL外标混合标准中间液（5.4.3）至10mL容量瓶中，用水定容至刻度。临用前配置。5.4.5天冬酰胺-15N2内标标准储备液（2.00mg/mL准确称取114mg（精确至0.0001g）天冬酰胺水合物-15N2标准品，用20%甲醇水溶解并转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3个月。5.4.6谷氨酰胺-15N2内标标准储备液（2.00mg/mL准确称取100mg（精确至0.0001g）谷氨酰胺-15N2标准品，用20%甲醇水溶解并转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3个月。5.4.7同位素内标混合溶液（天冬酰胺-15N22.00μg/mL和谷氨酰胺-15N22.00μg/mL）：分别准确移取1.00mL天冬酰胺-15N2和1.00mL谷氨酰胺-15N2储备液于1L容量瓶中，用水定容至刻度。临用前配置。5.4.8混合标准系列工作液：分别准确移取适量的外标混合标准工作液（5.4.4）和1.00mL同位素内20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL的混合标准系列工作液。临用前配置。6仪器和设备6.1液相色谱-串联质谱仪：配置电喷雾电离源。6.2分析天平：感量0.000lg。6.3漩涡混合器。6.4恒温水浴锅。6.5厨房机械料理机。7分析步骤7.1样品前处理3T/SATA079—2024选取新鲜蔬菜或水果样品500g并粉碎均匀，准确称取混合均匀的试样1.00g（精确至0.0001g）于20mL螺纹带盖玻璃瓶中，依次加入0.5mL蛋白酶溶液（5.2.3）、3.0mLTris缓冲液（5.2.5）、750μL（蔬菜）或250μL（水果）40mg/mLBHA溶液（5.2.2）和200μL甲醇，涡旋混匀。样品溶液于37℃恒温水浴酶解16h～18h。取出样品溶液，冷却至室温，将酶解液全部转移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。离心或者过滤得到试样清液。准确吸取1.0mL试样清液，稀释5倍获得试样溶空白试验：除不加试样外，均按上述样本分析步骤操作。7.2仪器参考条件7.2.1色谱条件液相参考色谱条件如下：a)色谱柱：五氟苯基柱（4.6mm×250mm，1.7μm）或性能相当者;b)流动相A：0.02%甲酸溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱程序见表1;c)流速：0.5mL/min;d)柱温：35℃;e)进样体积：5μL。表1超高效液相色谱洗脱梯度参考条件7.2.2质谱条件a)离子化模式：电喷雾正离子电离（ESI+）；b)扫描方式：多反应监测模式（MRM）；c)雾化器温度：300℃;d)离子传输毛细管温度：250℃;e)喷雾电压：3500V；f)鞘气流速：12.6L/min；g)辅助气流速：3.0L/min；h)监测离子对和定量离子对等信息详见表2。表2质谱参数天冬酰胺-N4T/SATA079—2024谷氨酰胺-N7.3标准曲线的制作将标准混合系列工作液分别注入液相色谱-串联质谱仪中，以目标化合物与其同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以标准系列工作液中目标化合物的浓度为横坐标，绘制标准曲线。标准溶液多反应监测（MRM）色谱图见附录A中图A.17.4定性和定量7.4.1保留时间被测试样中目标色谱峰与相应标准色谱峰的保留时间相比较，相对误差应在±2.5%之内。7.4.2离子丰度比在相同测试条件下，试样中的天冬酰胺和谷氨酰胺色谱峰保留时间与标准工作溶液相比，偏差范围在±2.5%以内，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的标准工作液相对丰度一致，其允许偏差不超过表3规定的范围。表3定性时离子丰度比的最大允许偏差7.4.3试样溶液的测定将处理完毕的试样（7.1）按仪器参考条件（7.2）进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。8结果计算将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：式中：X——试样中天冬酰胺、谷氨酰胺的含量，单位为毫克每百克（mg/100gP——由标准曲线得到的试样溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mLP0——由标准曲线得到的空白试验溶液中被测化合物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（gf——试样上清液稀释倍数；100——单位换算系数；1000——单位换算系数。结果保留三位有效数字。9灵敏度、精密度5T/SATA079—20249.1灵敏度以3倍信噪比（S/N=3）对应的目标物浓度