不同方法提取柳叶蜡梅挥发油成分及其抗氧化性、抑菌性的比较

柳叶蜡梅（ChimonanthussalicifoliusH.H.Hu）是中国特有的一种半常绿灌木，主要分布在浙江省中南部、安徽省南部和江西省北部等地，是少数兼具观赏性、食用性和药理活性的植物[1-2]。研究表明，柳叶蜡梅叶中含有丰富的挥发油类物质，而挥发油是柳叶蜡梅的主要药效物质基础之一，具有消炎杀菌、抗病毒、抗氧化和提高机体免疫力等功效[3-6]，具有很大的开发潜力。目前，对柳叶蜡梅挥发油的研究主要集中在成分分析[7-12]方面，对于同时使用3种方法提取柳叶蜡梅挥发油的化学成分、抗氧化和抑菌性差异的研究较少。本研究旨在利用挥发油提取器法、同时蒸馏萃取法、水蒸气蒸馏法提取柳叶蜡梅中的挥发油，并通过比较其得率、化学成分、抗氧活化和抑菌活性差异，为柳叶蜡梅的进一步研究及开发利用提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1材料与试剂柳叶蜡梅干叶，庆元县三禾元农业发展有限公司。大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、黑曲霉菌（Aspergillusniger）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），杭州武洋生物科技有限公司。正己烷，分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；无水硫酸钠、无水乙醇，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)diammonuimsalt，ABTS]，高纯试剂，合肥博美生物科技有限责任公司；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，生物试剂，广东环凯微生物科技有限公司。1.1.2仪器与设备水蒸气发生装置，挥发油测定仪（规格5mL，精度0.1mL），四川蜀牛玻璃仪器有限公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；同时蒸馏萃取装置，天长市康鹏实验设备有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计（双光束），北京普析通用仪器有限责任公司；7890A-5975C气相色谱质谱联用仪，AgilentTechnologiesInc。1.2实验方法1.2.1柳叶蜡梅挥发油的提取方法（1）挥发油提取器法提取柳叶蜡梅挥发油。取柳叶蜡梅干叶粉碎，过40目筛，称取100g粉末置于2L蒸馏瓶中，加入12倍量的纯水，充分浸泡混合，连接挥发油提取装置。从冷凝管上端敞口处添加纯水直到没过挥发油提取器刻度线，电热套170℃加热10h，待冷却后打开活塞收集挥发油，加入适量无水硫酸钠于收集的挥发油中以去除水分[13]，滤出无水挥发油，称重，计算挥发油得率。（2）同时蒸馏萃取法提取柳叶蜡梅挥发油。称取100g柳叶蜡梅粉末置于2L蒸馏瓶中，加入12倍量的纯水，充分浸泡混合，将含物料的2L蒸馏瓶置于同时蒸馏萃取装置的重相一端，电热套170℃加热；量取200mL正己烷置于同时蒸馏萃取装置轻相一端，水浴50℃加热。连续提取10h后，收集萃取液，加入适量无水硫酸钠于萃取液中以去除水分，过滤，20℃减压浓缩，收集挥发油，称重，计算挥发油得率。（3）水蒸气蒸馏提取柳叶蜡梅挥发油。称取100g柳叶蜡梅粉末置于2L蒸馏瓶中，连接至水蒸气发生装置，蒸馏提取10h。收集馏出液，用适量正己烷萃取3次，合并萃取液，20℃减压浓缩，收集挥发油，称重，计算挥发油得率。（4）挥发油得率计算。计算提取率，提取率=柳叶蜡梅挥发油质量/柳叶蜡梅粉末总质量×100%，每种方法平行操作6次。1.2.2GC-MS分析（1）GC条件。进样口温度：230℃，进样量：1μL，分流比为20∶1，色谱柱：HP-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）。升温程序：初始温度为70℃，以10℃·min-1升至280℃，保持5min。（2）MS条件。电子电离源，离子源温度150℃；溶剂延迟2min，全扫描模式，扫描质量范围为50～500amu。采用NISTMSSearch2.0数据库进行挥发性成分的定性分析。经CA-074预处理后再加LPS刺激，相比于单纯使用LPS刺激，CA-074+LPS组小鼠的肝组织变性坏死显著减轻，肝组织膨胀明显缓解，仅有少量空泡存在。1.2.3抗氧化活性测定本研究选取DPPH法和ABTS法对柳叶蜡梅挥发油的抗氧化活性进行测定，参考标准GB/T39100—2020[14]，并进行适当修改。（1）DPPH法测定抗氧化活性。DPPH法的实验原理为挥发油中抗氧化成分提供的1个电子可与DPPH·自由基配对结合，使DPPH·自由基的特征性紫色变为无色或黄色，而后用紫外分光光度计测定反应后的吸光度，可以用来判定挥发油的抗氧化能力。称取DPPH用适量无水乙醇避光超声充分溶解，用无水乙醇配制成5μg·mL-1的DPPH溶液，现配现用。取柳叶蜡梅挥发油用无水乙醇配制成1mg·mL-1、3mg·mL-1、5mg·mL-1、10mg·mL-1、15mg·mL-1、20mg·mL-1、30mg·mL-1和40mg·mL-1的供试品溶液。每个浓度下，取3只试管，第一支中加入1mL样品溶液，3mLDPPH溶液，第二支中加入1mL样品溶液，3mL无水乙醇，第三支加入1mL无水乙醇，3mLDPPH溶液，室温避光反应60min，于517nm处测定吸光度，分别为A1、A0、A2，DPPH的自由基清除率=[1-（A1-A0）/A2]×100%。以清除率（Y）对药物浓度（X）进行回归拟合[15]，根据对数函数方程求出清除率为50%时药物的浓度（IC50）。（2）ABTS法测定抗氧化活性。挥发油中抗氧化成分与ABTS-自由基反应后使其褪色，在734nm处的吸光值降低，反应后的吸光度用紫外可见分光光度计测定，来判定挥发油的抗氧化能力。称取ABTS母液，用95%乙醇稀释至吸光度值在0.7±0.02（OD734nm），作为测定溶液，该溶液现配现用。取柳叶蜡梅挥发油用无水乙醇配制成1mg·mL-1、3mg·mL-1、5mg·mL-1、10mg·mL-1、15mg·mL-1、20mg·mL-1、30mg·mL-1和40mg·mL-1的供试品溶液。每个浓度下，取两支试管，第一支中加入0.4mL样品溶液，3.6mLABTS溶液，室温避光反应5min，第二支中加入0.4mL无水乙醇，3.6mLABTS溶液，室温避光反应5min，于734nm处测定吸光度，分别为A1、A0，自由基清除率=[（A0-A1）/A0]×100%。以清除率（Y）对药物浓度（X）进行回归，根据对数函数方程求出清除率为50%时药物的浓度（IC50）。1.2.4抑菌性测定（1）菌种活化及菌悬液制备。于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌和黑曲霉菌5种菌种磁珠，细菌在37℃下培养24h，真菌在28℃下培养48h后，分别挑取对应菌落转接在0.9%的无菌生理盐水中，制成106～107CFU·mL-1的菌悬液，备用。1.3数据处理提取实验所得数据以平均值±标准差（x-±s）表示。采用NISTMSSearch2.0数据库进行挥发性成分的定性分析，按峰面积归一化法进行计算求得各化学成分在挥发油中的相对含量。采用WPS表格对抗氧化和抑菌性实验结果进行处理。2结果与分析2.1不同方法的提取率不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油提取率见表1，所提取的挥发油均为淡黄色油状物，其中，挥发油提取器法的提取率最高，蒸馏萃取法次之，水蒸气蒸馏法得率最低。表1不同方法提取的挥发油提取率表2.2柳叶蜡梅挥发油的化学成分对不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油进行GC-MS分析，3种方法的总离子流色谱图见图1、图2、图3，不同方法提取的挥发油化学成分及相对含量见表2。由图1、图2、图3和表2可知，3种提取方法鉴定出的化学成分差异较小，而相对含量差别较大。挥发油提取器法鉴定出22种化合物，占挥发油含量的99.33%，含量排在前5的成分依次为桉叶油醇（48.593%）、黑蚁素（14.34%）、喇叭烯氧化物-(I)（8.006%）、石竹素（7.309%）、α-蒎烯（3.777%）。同时蒸馏萃取法鉴定出24种化合物，占挥发油含量的98.968%，含量排在前5的成分依次为桉叶油醇（41.994%）、黑蚁素（16.884%）、石竹素（9.126%）、喇叭烯氧化物-(I)（7.670%）、γ-榄香烯（3.071%）。水蒸气蒸馏法鉴定出27种化合物，含量排在前5的成分依次为桉叶油醇（29.378%）、黑蚁素（20.495%）、喇叭烯氧化物-(I)（11.003%）、石竹素（10.063%）、γ-榄香烯（3.946%）。3种提取方法共鉴定出28种化合物，共有化合物有21种，相对含量比例不同，21种共有成分相对含量分别为99.333%、98.116%、96.275%，高含量的共有成分中，黑蚁素、石竹素具有较高的药理活性。水蒸气蒸馏法鉴定出成分多于其他2种方法。图1挥发油提取器法谱图图2水蒸气蒸馏法谱图图3同时蒸馏萃取法谱图表2不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油化学成分及相对含量表2.3柳叶蜡梅挥发油的抗氧化性2.3.1柳叶蜡梅挥发油的DPPH自由基清除能力由图4可知，3种方法提取的挥发油对DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除率与剂量呈现出依赖关系。对数回归方程及IC50值见表3。由图4和表3可知，3种方法提取的挥发油清除DPPH自由基能力为水蒸气蒸馏法＞同时蒸馏萃取法＞挥发油提取器法。图4不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油清除DPPH自由基能力图表3不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油对DPPH自由基能力对数回归方程及IC50值表2.3.2柳叶蜡梅挥发油的ABTS自由基清除能力不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油清除ABTS自由基能力见图5，实验结果可得，3种方法提取的挥发油对DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除率与剂量呈现出依赖关系。对数回归方程及IC50值见表4。由图5和表4所得，3种方法提取的挥发油清除ABTS自由基能力为水蒸气蒸馏法＞同时蒸馏萃取法＞挥发油提取器法。图5不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油清除ABTS自由基能力图表4不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油对ABTS自由基能力对数回归方程及IC50值表2.4柳叶蜡梅挥发油的抑菌性由表5可知，3种方法提取的柳叶蜡梅挥发油对鼠伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有较为明显的抑制作用，对大肠埃希氏菌和霉菌无明显抑制作用。其中，挥发油提取器法和水蒸气蒸馏法提取的挥发油对金黄色葡萄球菌抑制作用最为明显，同时蒸馏萃取法提的挥发油对蜡样芽孢杆菌抑制作用最为明显。表5不同方法提取的柳叶蜡梅挥发油对5种菌的抑菌圈直径表3结论与讨论采用挥发油提取器法、同时蒸馏萃取法、水蒸气蒸馏法3种方法对柳叶蜡梅挥发油进行提取；采用GC-MS对3种柳叶蜡梅挥发油成分进行分析；以对DPPH自由基能力和ABTS自由基清除能力作为判定指标，研究3种挥发油体外抗氧化活性；以抑菌圈实验结果作为评价指标，研究3种挥发油体外抑菌性。实验结果表明，采用挥发油提取器法提取柳叶蜡梅挥发油得率较高，同时蒸馏萃取法和水蒸气蒸馏法得率稍低，可能与提取后萃取浓缩损耗有关。3种方法提取的柳叶蜡梅挥发油化学成分均以萜类化合物为主，其中以桉叶油醇含量最高，与杨华等[8]、史小娟等[17]研究结果类似。其中，以水蒸气蒸馏法提取的挥发油鉴定出的化合物种类最多。3种方法提取的柳叶蜡梅挥发油均有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力与挥发油浓度呈正相关关系，3种方法提取的挥发油对抗氧化活性大小顺序均为水蒸气蒸馏法＞同时蒸馏萃取法＞挥发油提取器法，可能与挥发油中黑蚁素含量有关，研究表明[18]，黑蚁素具有一定的抗氧化性。3种挥发油成分中，水蒸气蒸馏法提取挥发油黑蚁素相对含量占比最高。抑菌实验结果显示，3种方法