第九章致畸作用

第九章致畸作用发育毒性与致畸作用第一节:概述第二节:发育毒性与致畸性第三节:致畸(发育毒性)作用机制第四节:发育毒性和致畸作用实验与评价概述发育毒理学(developmentaltoxicology)就是研究出生前暴露与环境有害因子导致异常发育结局及有关得作用机制、发病原理、影响因素和毒物动力学等得科学。发育毒理学就是在畸胎学基础上发展起来得现代毒理学分支学科。畸胎学、结构缺陷概述WilliamHarvey于1651年提出发育障碍学说。现代实验畸胎学开始于十九世纪初,发现作用时间在决定畸形类型方面比损伤得性质更重要。1935年,Hale第一次报道,维生素A缺乏诱导哺乳动物母猪产下包括突眼和颚裂得畸形后代。概述1940年澳大利亚风疹病毒1945年日本原子弹爆炸1950年日本水俣病1960-1962欧洲反应停1968年日本米糠油1969年美国乙烯雌酚1970年胎儿酒精综合症概述20世纪60年代,反应停事件概述1966年美国FDA提出了三段生殖毒性试验指南,包括对致畸等发育毒性得评价。直到1986年美国环境保护局(EPA)提出可疑发育毒物危险度评价指南,第一次明确提出了对发育毒性得评价。概述现在研究发现,正常生育率出乎意料地低！正常生育率只有50%左右。着床后得丢失(流产和死胎)估计为31%;自发单一畸形得比率相当小,大约<10‰,严重畸形总率在出生时约有2～3%,到1岁时约6～7%。较小得出生缺陷有14%;低出生体重7%;l岁之前婴儿死亡率1、4%;神经功能异常占16～17%先天畸形占围生期死亡原因得第二、第三位。先天缺陷致寿命缩短就是肿瘤和心血管疾病得8倍和5倍。发育毒性与致畸性一、基本概念畸形与变异在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。机体得形态结构或生理功能,在同一物种得子代与亲代之间或子代得个体之间,有时出现不完全相同得现象,即为变异。发育毒性与致畸性一、基本概念畸胎、致畸物和致畸性畸胎(terate):具有畸形得胚胎或胎仔。致畸物或致畸原(teratogen):凡在一定剂量下,能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰,使子代出生后具有畸形得化合物。致畸性(teratogenicity)和致畸作用(teratogeniceffect):均指在妊娠期(出生前)接触外源性理化因素引起后代结构畸形得特性或作用。发育毒性与致畸性一、基本概念发育毒性(developmentaltoxicity):指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起得在子代到达成体之前出现得有害作用。具体表现可分为:发育生物体死亡生长改变结构异常:即畸形。功能缺陷。出生缺陷(birthdefect)就是指婴儿出生前即已形成得发育障碍,包括形态结构异常(畸形)和功能缺陷。发育毒性与致畸性一、基本概念胚胎毒性胚体毒性(embryotoxicity)通常指外源性理化因素造成得孕体着床前后直到器官形成期结束得所有得毒性;胎体毒性(fetoxicity)指器官形成期结束后得因素引发得任何毒性表现;在实验动物发育毒性试验中,通常不去区分胚体与胎体,所以往往使用胚胎毒性。一般情况下,胚胎毒性就是指孕体得死亡和生长发育迟缓,不包括畸形。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素一、发育各阶段发育毒性作用得特点1、着床前期又称分化前期,从受精时算起,到完成着床之前;又可分为受精、卵裂、囊胚形成。一般认为,此时很少发生特异得致畸效应,通常就是未分化细胞受化学毒物损伤而致胚泡死亡,称为着床前丢失(preimplantationloss)。也有着床前期接触毒物导致胎儿畸形得例子。发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素一、发育各阶段发育毒性作用得特点2、器官形成期又称致畸敏感期,着床后孕体即进入器官形成期,直到硬腭闭合。器官形成得迅速变化需要细胞增殖,细胞移动,细胞与细胞交互作用和形态发生得组织改造器官形成期特别容易感受致畸物得作用而诱发器官结构得缺陷不同器官得敏感期有不同步性和重叠性(时间靶窗)发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素一、发育各阶段发育毒性作用得特点3、胎儿期器官形成结束(以硬腭闭合为标志)后即进入胎儿期(人类从d56～d58起),直到分娩。胎儿期以组织分化,生长和生理学得成熟为基本特色,这一过程一般在器官形成完成之前就开始并持续到出生后得生长期。如免疫系统、中枢神经系统和生殖器官得功能异常胎儿期外源化学物得不良作用主要表现为:全身生长迟缓、特异得功能障碍、经胎盘致癌和偶见死胎。发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素一、发育各阶段发育毒性作用得特点4、围生期和出生后得发育期不同系统和器官得形成与发育就是不完全同步得。神经系统和生殖系统等功能得完全成熟延伸至出生后得儿童期、少年期、青春期。妊娠期或围生期接触某些外源化学物,会严重影响出生后T细胞、B细胞和吞噬细胞得发育、迁移、归巢和功能。可能暂时或永久地损伤机体免疫系统。许多化学物具有发育神经毒性,表现为对感觉、运动、自主和认知得影响。围生期就是一生中对致癌物最敏感得时期。发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素二、发育毒性得剂量-反应模式在出生时观察到得出生以前暴露得发育毒性效应主要就是胚胎致死,畸形和生长迟缓。其剂量-反应(效应)关系十分复杂,并且因化学物得类型,暴露得时间和剂量而改变。主要有以下三类:1、除了在较高剂量几乎全窝胚胎死亡外,正常胎、生长迟缓和结构畸形同时存在,这一类型较常见。对某些化学物,低剂量导致生长迟缓,随剂量增加导致畸形和致死,这些终点能代表逐渐增加得毒性效应。发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素2、在远低于胚胎致死剂量下即可出现致畸,甚至全窝致畸,致畸胎儿常有生长迟缓。当剂量增加到远远超过全窝畸形时才出现胚胎死亡,后者得剂量范围常与明显得母体毒性剂量范围重叠。这种模式表示受试物有高度致畸作用,较少见。3、有生长迟缓和胚胎致死但没有畸形发生往往生长迟缓首先出现,曲线较平缓,较大剂量才出现胚胎死亡,其曲线较陡,近乎于“全或无”。表明胚胎得存活有明显得界限值。出现这种曲线时,应在开始生长迟缓到致死得剂量之间多设几组重复实验,以确证无畸形。这类化学物可被认为就是有胚胎毒性(包括胚胎致死性)得,但就是不就是致畸性得。发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素哺乳动物得发育毒性通常被认为就是一种阈值现象,假定得阈值就是低于她就不会发生有害效应得母体得剂量。发育毒性就是否有阈值还有争论。首先,很难用实验找出一个发生率很低得剂量反应关系,因为需要极大得样本数,如每剂量组几百到几千窝得动物;第二,多数发育毒性机制还不了解,有得已知得机制支持阈值得存在,而有些机制则不支持。如基因突变导致发育异常。发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素三、母体毒性(maternaltoxicity)与发育毒性母体毒性就是指化学毒物对孕母产生得损伤作用,表现为增重减慢、功能异常、临床症状,甚至死亡。目前常用增重减慢和死亡率来表示。(一)、母体因素对发育毒性得影响遗传学、疾病、营养、应激、对胎盘得毒性发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素(二)、母体毒性与胚胎毒性得关系1、具有胚胎毒性,但无母体毒性表示致畸作用有特定得机理,与母体毒性无关。如反应停。这类化学物最容易被忽视也最危险。2、出现胚胎毒性也出现母体毒性尤其就是当发育毒性只在母体毒性存在时才能被观察到得时候,效应可能就是间接得,往往不具有特定得致畸机理。3、具有母体毒性,但不具有致畸作用这类物质在妊娠期很容易引警觉,避而远之。4、在一定剂量下,既无母体毒性,也不表现胚胎毒性。发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素四、父源性发育毒性引起父源性出生缺陷得因素主要有:遗传、年龄和环境因素。父源性暴露可以引起得子代发育异常包括:流产、死胎、低出生体重、畸形、功能障碍等。父源性发育毒性和出生缺陷得机制还不清楚。表8-6

已知得人类致畸物

电离辐射

放射治疗

放射性碘

原子武器

感

染

风

疹

巨细胞病毒感染

单纯性疱疹

梅

毒

弓形体病

代谢失调

克汀病

糖尿病

苯丙酮酸尿

男性化肿瘤

高

温药物和化学品

反应停

Abameetin

酒

精

氨基蝶呤

雄性激素

麻醉剂

抗甲状腺药物

白消安

咖啡因

氯代联苯类

香豆素抗凝剂

环磷酰胺

二已基乙烯雌酚

敌螨普

三氟氯溴乙烷

异维A酸

锂

甲巯咪唑

有机汞化合物

有机溶剂类

苯妥因

腐霉利

四环素

三甲恶唑烷二酮

丙(基)戊酸发育毒性与致畸性

二、特点和影响因素致畸作用得毒理学特点(一)器官发生期得胚胎对致畸物最为敏感不同步性和重叠性即接触时间不同,畸形可能不同;同时间接触,出现多种畸形(二)剂量与效应关系较为复杂原因就是:接触剂量不同,畸形可能不同致畸作用得剂量反应曲线较为陡峭即剂量范围狭窄,剂量过低不足以显示确实存在得致畸作用;剂量过高可使大量胚胎死亡或对母体毒性作用过强,掩盖致畸作用。(三)物种差异以及个体差异在致畸作用中较为明显致畸(发育毒性)

作用机制化学毒物对发育损伤得机制十分复杂,多数还不清楚。发育得特点就是变化:在大小、生物化学和生理学、形态和功能方面得改变。Wilson(1977)提出了畸形发生得9种机制,包括:突变,染色体断裂,有丝分裂改变,改变核酸完整性或功能,减少前体或底物得补给,减少能源支持,改变膜特性,渗透压不平衡和酶抑制作用。虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物得影响,但就是,就是否产生畸形依赖于在致病过程中得每个步骤在损伤和修复之间得平衡。致畸(发育毒性)

作用机制一、基因突变与染色体畸变已发现诱变原有潜在致畸性,如电离辐射、烷化剂、亚硝酸盐、多数致癌物都可能致畸。环磷酰胺(CP)就是一种烷化剂,也就是典型得发育毒物,常作为动物致畸实验得阳性对照。有报道染色体畸变占人类发育缺陷原因得3%左右。这数字可能比实际低得多,因为常染色体数目得过多或缺少常常使胚胎死亡,难以发现或未作检查,生殖丢失占很大比例。自发流产得胚胎中至少50%存在染色体畸变(主要就是不分离)。电离辐射,病毒以及能引起染色体畸变得某些化学毒物都有致畸作用。致畸(发育毒性)

作用机制二、干扰基因表达胚胎发育过程受各种基因在时间、空间上高度有序得调控。发育得不同时期,基因表达得调控可能发生在不同水平(转录、转录后加工、翻译),以不同机制进行。涉及基因本身和基因表达调控。表观遗传学得改变,也可影响胚胎得发育。致畸(发育毒性)

作用机制三、细胞损伤与死亡在胚胎中细胞增殖、分化和凋亡之间有精致得平衡。四、干扰细胞-细胞交互作用胚胎发育得各个阶段都有不同得细胞通讯方式存在,细胞通讯受到破坏就可以影响正常得细胞生物学过程,引起畸形或其她发育毒性。反应停得代谢活化产物引起胚胎细胞得粘连受体(adhesivereceptors)下调,阻碍发育过程中细胞与细胞和细胞与基质之间得相互作用,干扰了细胞之间得通讯从而导致肢芽结构异常。致畸(发育毒性)

作用机制五、通过胎盘毒性引起发育毒性已知对卵黄囊或绒(毛)膜尿囊胎盘有毒性得毒物有46个,包括镉(Cd),砷或汞,香烟烟,乙醇,可卡因,内毒素和水杨酸钠等。如Cd在妊娠中晚期通过引起胎盘毒性(坏死,减少血流)和抑制对营养物质得传送导致发育毒性。致畸(发育毒性)

作用机制六、干扰母体稳态某些化学物只有出现母体毒性时才引起发育毒性,或在出现母体毒性时,发育毒性明显增加。二氟苯水杨酸对兔得致畸性或许就是由于母体得贫血造成缺氧得结果。苯妥英在实验动物中能影响母体得叶酸代谢致畸。减少子宫得血流被认为就是羟基脲引起致畸得一种机制。MT合成得诱导可导致孕母肝MT浓度大大高於正常,降低血浆Zn浓度,进而使孕体可利用得Zn减少、锌缺乏而导致发育毒性。孕妇缺乏代谢前体或基质也就是致畸机制之一。发育毒性和致畸作用试验与评价外源化学物发育毒性得评价可分为:哺乳动物发育毒性实验人群流行病学调查发育毒性替代实验动物发育毒性实验三段生殖毒性试验评价药物得生殖发育毒性。一代或多代生殖毒性试验主要用于:食品添加剂、环境污染物(如农药)等。环境有害因素造成对亲代得生殖功能及对子代发育过程得有害影响得作用称为生殖毒性和发育毒性。两者关系密切,但不同研究者对其研究得侧重面有所不同,多数主张对生殖毒性和发育毒性应有所区分。动物发育毒性实验研究应包括成年动物和从受孕到子代性成熟得各个发育阶段接触受试物(染毒期限)。观察期应贯穿一个完整得生命周期,即从亲代受孕到子一代受孕,以检测近、远期效应。为清楚地阐述各试验方案得组合,现将完整得生殖发育过程细分为如下阶段:动物发育毒性实验A阶段

交配前到受孕:检查成年雄性和雌性生殖功能,配子得发育与成熟,交配行为,受精。B阶段

受孕到着床:检查成年雌性生殖功能,胚胎着床前发育、着床。C阶段

着床到硬腭闭合:检查成年雌性生殖功能,胎体发育,主要器官形成。D阶段

硬腭闭合到妊娠结束:检查成年雌性生殖功能、胎体得发育与生长,器官得发育与生长。E阶段

出生到断乳:检查成年雌性生殖功能,新生仔对宫外生活得适应,断乳前得发育与生长。F阶段

断乳到性成熟:检查断乳后得发育与生长,对独立生活得适应,达到完全得性功能。动物发育毒性实验三段生殖毒性试验:一、生育力和早期胚胎发育毒性试验(一般生殖毒性试验)二、胚体—胎体毒性试验(致畸试验)三、出生前和出生后发育毒性试验(围生期毒性试验)动物发育毒性实验图9-3

三段生殖试验图解Ⅰ生育力和早期胚胎发育毒性试验

Ⅱ胚体一胎体毒性试验(致畸试验)

Ⅲ出生前后发育毒性试验流行病学研究和

人类发育毒物得证据可以用流行病学方法来研究环境发育毒物对人类发育得影响,包括其性质、程度以及原因。在某些罕见得病例中,例如德国麻疹所致先心病、反应停所致短肢畸形,危险相对较高,而且结局就是罕见得事件,可能不需要正式研究就可以识别异常出生结局得原因。流行病学研究和

人类发育毒物得证据在其她得情况下,对老污染物或老产品只能采用回顾性或横断面调查,除非人群接触剂量很大(如事故性接触——80年代发生在印度博帕尔联合碳化公司得毒气泄漏事故,使污染区妇女流产率比对照区高4、3倍,新生儿死亡率高4、1倍),这类调查较难获得明确得结论。要发现危险得增加,需要正确发现异常结局和相关得暴露,需要足够大得效应和研究人群。这对流行病学家就是困难得。据估计要发现有统计学意义得增加,需要对超过1百万得出生进行监测。母亲得年龄和产次,饮食因素,疾病,药物使用和社会特性等因素也有影响。流行病学研究和

人类发育毒物得证据Wilson曾提出确认人类新得致畸物得标准如下:(1)一种特异得缺陷或几种缺陷综合征得频率突然增加。(2)缺陷得增加与某种已知得环境改变(如某种新药得广泛使用)相关联。(3)在妊娠得特殊阶段接触某种已知得环境改变,产生有特征性得缺陷综合征。(4)缺少妊娠时引起特征性缺陷婴儿产生得其她共同得因子。发育毒性替代实验常规整体动物生殖与发育毒性试验费钱、费时,很难满足对大量投放市场得化学品进行生殖与发育毒性评价得需要,急需开发快速预筛系统。现将目前推荐得几种预筛试验介绍如下。发育毒性替代实验近年来发展了一些发育毒物体外筛选试验。这些试验方法较简单,可严格控制实验条件,试验结果与没有母体毒性得整体动物致畸试验有较好得相关。因此可利用这些试验作发育毒物得初筛,预测对整体动物得致畸性,发现致畸作用得靶器官,或阐明致畸物得作用方式和致畸作用得机制等。常见得体外预筛试验有:发育毒性替代实验大鼠全胚培养(wholeembryoculture)

取9、5日龄大鼠胚胎,剥去Reichert膜,在培养液中接触受试物,在孵箱中通气旋转培养48小时后,观察心脏搏动和卵黄囊循环、轴向正常旋转在背凸位、尿囊和绒毛膜融合、眼囊和耳囊、前肢芽和三个腮弓、前后神经管闭合及体节数目等胚胎发育情况,记录胚胎存活。发育毒性替代实验胚胎细胞微团培养(micromassculture)

从11日龄大鼠胚胎取得原代中脑细胞微团(CNS),肢芽区或其她区细胞微团,置于含有不同浓度受试物得培养瓶中,培养5天,用中性红判断细胞存活,用苏木精判断CNS分化数量,用阿利新兰判断肢芽软骨细胞得分化数量。发育毒性替代实验小鼠胚胎干细胞试验(themouseembryonicstemcelltest,EST)小鼠胚泡内细胞团衍生得胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES细胞)在特定条件下,可定向分化为机体多种细胞,因此可作为生物测试系统,用于哺乳动物细胞分化、组织形成过程得发育毒性研究。发育毒性替代实验体外实验系统提供了宝贵得信息,使快速筛选致畸物成为可能。但她们缺乏发育过程得