遗传性耳聋基因检测试剂盒（PCR-流式荧光杂交法）（CSZ2200216）

申请人名称：广州达安基因股份有限公司 3 3 3 3 4 4 6 10 11 一、申请人名称广州达安基因股份有限公司二、申请人住所广州市高新技术产业开发区香山路19号三、生产地址广州市高新技术产业开发区香山路19号；广州市高新技术产业开发区荔枝山路6号；广州市黄埔区香山路17号B104号一、产品概述（一）产品主要组成成分本试剂盒主要组成成分包括试剂I（PCR扩增试剂LELPCR反应液A、LELPCR反应液B、LEL酶系、LEL阳性质控品、LEL正常质控品、PCR空白对照，试剂II（杂交试剂LEL多重微球杂交液、LEL5×显色工作液、LEL显色稀释液和杂交空白对照。（二）产品预期用途本试剂盒用于体外定性检测新生儿干血斑样本基因组DNA中4个遗传性耳聋基因中的17个位点，包括GJB2基因的35delG、176_191del16、2insAACG位点、GJB3基因的538C>T位点、SLC26A4基因的1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、2168A>G、IVS7-2A>G、IVS15+5G>A位点和线粒体12SrRNA基因的1494C>T、1555A>G位点。该产品检测结果可用于遗传性耳聋的辅助诊断，可作为常规物理听力筛查的补充，特别是可发现常规物理听力筛查无法检出的药物性致聋基因携带者和迟发性耳聋基因携带者。存在部分听力筛查未通过且听力异常，但本产品检测结果为阴性的情况。检测结果仅代表对部分遗传性耳聋相关基因位点的检测，不作为诊断和排除遗传性耳聋的唯一标准。如需确诊病例，应结合患者其他诊断信息对检测结果进行综合判断，或依据相关的诊疗流程对遗传性耳聋进行诊断。（三）产品包装规格24人份/盒、48人份/盒。（四）产品检验原理本试剂盒基于流式荧光杂交法的原理，针对GJB2基因35insAACG位点；GJB3基因538C>T位点；SLC26A4基因1174基因1494C>T、1555A>G位点共17个位点设计PC交探针；利用多重PCR技术获得生物素标记的PCR产物；突变位点的野生型探针（N）和突变型探针（M）与微珠进行共价交联；生物素标记的PCR产物与微珠上偶联的探针进行特异性杂交；杂交过程中加入的显色剂能与PCR产物上标记的基团发生亲和反应；经过上机检测，设备能直接获得每种探针对应的信号值；根据野生型探针与突变型探针的信号比值对检测结果进本试剂盒添加了相关的防污染组分（尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG），其作用机理是选择性水解断裂含有dUTP的双链或者单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消二、临床前研究概述（一）主要原材料研究1.主要原材料的选择本产品在制备过程中所用的主要原材料包括引物、探针、霉亲和素藻红蛋白、正常人基因组和耳聋杂合质粒，其中正常人基因组、耳聋杂合质粒为申请人自行生产，引物、探针、热启动Taq酶、dNTPs、UDG酶、微球、LELdpanti-POS、链霉亲和素藻红蛋白为外购。申请人对主要原材料通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商，制定了各主要原材料质量要求并经检验合格。2.企业参考品和质控品的设置情况申请人设计了完整的企业参考品，包括阳性参考品17份、阴性参考品6份、检测限参考品19份、重复性参考品7份。除1份阴性参考品由质粒制备而成外，其余48份参考品均由临床新生儿干血斑样本提取的基因组DNA制备而成。各项企业参考品综合用于产品检测准确性、检测限、特异性和重复性评价。本试剂盒设置了LEL阳性质控品、LEL正常质控品和PCR空白对照，用于检测过程中试剂和仪器的质量控制。其中，LEL阳性质控品为耳聋杂合质粒、LEL正常质控品为正常人基因组、PCR空白对照为纯化水。此外，杂交体系中还设置了杂交监控探针POS，用于监控样本杂交是否正常。（二）生产工艺及反应体系研究申请人通过企业内部试验确定最佳的生产工艺及反应体显色稀释液和质控品的配液工序、分装工序、组装工序等，同时对试剂用量、PCR反应条件、提取方法、杂交反应条件、适用仪器、样本核酸浓度以及微球与探针的结合工艺等进行研究。（三）分析性能评估本试剂盒分析性能评估内容主要包括：核酸提取或纯化性能、准确度、精密度、检出限、分析特异性等。申请人提交了有效运行的质量管理体系下生产的产品在适用机型上的性能评1.核酸提取或纯化性能在核酸提取性能研究中，申请人评估了提取试剂的纯度和浓度，并在适用仪器上进行验证，结果表明配套使用的核酸提取或纯化试剂的核酸提取效果满足产品使用需求。2.准确度在准确度研究中，申请人分别使用三批试剂对企业参考品及临床样本进行试验验证，企业参考品和临床样本的检测结果均符合要求，符合率均为100%。3.精密度在精密度研究中，申请人分别使用三批试剂对中、低浓度及检测限浓度水平的5个常见突变型和野生型的样本进行为期20天的检测，结果表明日内、日间、批内、批间、不同操作者间、不同地点间的重复性及精密度均符合要求。4.检出限在检出限研究中，申请人分别使用三批试剂对试剂盒检测范围内17个不同位点突变型别的样本进行梯度稀释，对系列浓度样本分别进行20次重复检测，以所有型别样本符合率均≥95%的浓度作为最低检出限，确定该产品的最低检出限为2ng/μL；通过对不同位点突变型别的样本进行检测限验证，最终确认申报产品最低检出限为2ng/μL。在线粒体异质率检出限研究中，申请人使用三批试剂对最低检测限水平下不同异质率的线粒体突变样本检测，以所有型别样本符合率均≥95%的异质率确定为本试剂盒的检测限水平下线粒体异质率；通过对不同线粒体位点突变的样本进行检测限水平下的异质率验证，最终确认在检测限2ng/μL情况下，线粒体突变样本的异质率为50%。5.分析特异性分析特异性研究包括交叉反应研究和干扰研究。在交叉反应研究中，申请人分别采用三批试剂对核酸序列相近或具有同源性、待测位点附近的其他突变位点、各基因及突变位点间、非人类基因组、其他耳聋基因样本进行检测，结果显示申报产品均无交叉反应。在干扰研究中，申请人分别使用三批试剂对样本中可能含有的干扰物质进行评价，结果显示含高浓度的胆红素（20mg/mL）、甘油三酯（3000mg/dL）、血红蛋白（6g/dL）、胆固醇（5mg/mL）和白蛋白（1.0g/dL）的内源性干扰物质对申报产品的检测结果均无干扰；复合维生素善存片（最大浓度40mg/mL）及临床常用的血管紧张素转换酶抑制剂类降压药物卡托普利（最大浓度20mg/mL）的外源性干扰物质对申报产品的检测结果均无干扰。（四）阳性判断值研究申请人采用1886例新生儿干血斑样本，利以及百分位数法对阳性判断值进行确定研究，最终确定本试剂盒各位点不同基因型的阳性判断值参数。申请人进一步采用临床样本进行阳性判断值的验证，确认本试剂盒的阳性判断值设（五）稳定性研究申请人对申报产品的实时稳定性、使用稳定性、运输稳定性和样本稳定性进行了研究，确定了在各种条件下本试剂盒及样本的有效保存时间。货架有效期（实时稳定性）研究：采用三批试剂盒在实际储存温度条件下：试剂I（PCR扩增试剂）保存于-20±5℃,试剂II（杂交试剂）避光保存于2~8℃,每到一个时间节点取出进行检测，确定产品在实际储存温度条件下可稳定保存12个月。此外，申请人对申报产品的使用稳定性、运输稳定性和样本稳定性进行了研究，结果显示产品的性能均满足产品说明书声称的要求。三、临床评价概述本产品在珠海市妇幼保健院、成都市妇女儿童中心医院、南京市妇幼保健院、长沙市妇幼保健院四家临床试验机构进行临床试验，对比方法为耳聋基因检测临床参考方法sanger测序法进行比对，入组人群为新生儿。针对临床检测性能研究，入组病例10233例，其中对比方法检测阳性病例599例，对比方法检测阴性病例9634例。试验结果显示：本产品与对比方法对比，阳性符合率为100%（95%CI：99.36%，100%），阴性符合率为100%（95%CI：99.96%，100%）。针对耳聋基因筛查试验，临床试验共入组病例10156例，其中对比方法检测阳性病例555例，其中药物性耳聋基因阳性病例34例，迟发性耳聋基因阳性病例207例，对比方法检测阴性病例9601例，申报产品与对比方法检测结果阳性一致率：100%（95%CI：99.31%，100%）；阴性一致率100%（95%CI：99.96%，100%），试验体外诊断试剂与对比方法检测结果一致性良好。综上所述，临床试验结果显示本产品的临床性能满足技术审评要求。四、产品受益风险判定根据YY/T0316-2016《医疗器械－风险管理对医疗器械的应用》对产品进行风险分析。申请人对已知危险（源）进行风险评价，按照风险可接受准则判断每个危险(源）的风险是否达到可接受水平，对合理可行降低的风险、不经过风险/收益分析既判定为不可接受的风险采取控制措施，并对具体措施进行实施验证，同时重新对采取措施后的风险进行估计，确认其风险水平是否可接受。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中提1.本产品检测结果仅代表对部分遗传性耳聋相关基因位点的检测，不作为诊断和排除遗传性耳聋的唯一标准。如需确诊病例，应结合患者其他诊断信息对检测结果进行综合判断，或依据相关的诊疗流程对遗传性耳聋进行诊断。2.警示及注意事项：产品说明书中介绍了该产品检验方法的局限性及使用中的注意事项。依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第739号）、《体外诊断试剂注册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第48号）等相关医疗器械法规与配套规章，经对申请人提交的注册申报资料进行系统评价,申报产品符合安全性、有效性的要求，符合现有认知水平，建议准予注册。附件：产品说明书力筛查无法检出的药物性致聋基因携带者和迟发性耳聋基因携带者。存在部分听力筛查未通过且听力异常，但本产品检测结果为阴性的情况。检测结果仅代表对部分遗传性耳聋相关基因位点的检测，不作为诊断和排除遗我国听力残疾者约为2054万，占总残疾人口的24%。我国每年新增约3万先天时期，最终导致聋哑残疾。SLC26A4基因是引起迟发性耳上如果不采用基因筛查方法很难在药物致聋前发现，携带该基因突变患者需终身避免使用氨基糖甙类药物[4]。GJB3基因突变主要与迟发性高频听力型探针（N）和突变型探针（M）与微珠进行共价交联；生物素标记的PCR产物与微珠上偶联的探针进性杂交；杂交过程中加入的显色剂能与PCR产物上标记的基团发生亲和反应；经过本试剂盒添加了相关的防污染组分（尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG），其作用机理是选择性水解断盒热启动Taq酶、UDG酶、三磷酸脱氧核糖核苷液LEL5×显色工作液盒热启动Taq酶、UDG酶、三磷酸脱氧核糖核苷液LEL5×显色工作液ThermalCycler，厂家：LifeTechnologiesHoldi）；质控品说明：LEL阳性质控品为体外人工合成液态悬浮芯片检测仪（型号：MagPix，厂家：LuminexCorpo2.PCR试剂准备（试剂准备区）从试剂盒中取出LELPCR反应液A、LELPCR反应液B和LEL酶系，室温融34µL40µLPCR反应管B34µL40µL按上表配制完成后充分混合，分别配制成PCR反应管A和PCR反应管B，瞬时离心以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将40µL扩增体系分别分装到独立的PCR管中，做好标记，备用。3.加样（样本制备区）（2）每个样品分别取2.5µLA管产物和2.5µLB管产物加至各反应孔，总体积50µL，充分混匀，封板膜密封后），将上述杂交显色后的反应板直接放入Luminex200或（1）PCR空白对照：检测结果为所有位点的探针信号值均（3）LEL正常质控品：检测结果为试剂盒检测（6）杂交空白对照：用于杂交过程污染排查。在进行杂交过程污染cutoff值cutoff值N/M值N/M值cutoff值cutoff值N/M值N/M值////注：若某个位点的N/M值不落在任何一个区间范围，则该位点判读结果为灰区，需要进行复检cutoff值cutoff值N/M值N/M值cutoff值cutoff值N/M值N/M值////注：若某个位点的N/M值不落在任何一个区间范围，则该位点判读结果为灰区，），点的探针检测信号值均小于各自相应的cutoff值，所有位点的检测结果均为低信号。6.LEL正常质控品：用于监测PCR扩增体系及探针是否正常工），2168N大于cutoff值N对应的5117954.55.36492.561160.084718471032352.杂交用的PCR仪温控异常3.杂交过程PCR反应与微球混合不度是否高于试剂盒检测限。若低于建议提高样3.使用一代测序验证引物或探针结合位置是否某位点大部分样本落入1.定期校准，清洗维护仪器，定期更换仪器吸样针和导管。检查鞘液体积是否正常，检查废点4.P