分子生物学 第7章学习资料

第7章基因突变与交换GeneMutation&Crossing-Over基因突变和遗传重组是生物多样性形成的基础一切生物个体都是基因的突变体或遗传的重组体生物的进化过程就是突变体的自然选择的过程7.1.Pointmutation的类型

7.2.突变发生的机理7.3.保证遗传稳定的机制7.4.基因重组交换的分子生物学7.1.Pointmutation的类型

染色体水平上的结构变异和数目改变(细胞遗传学研究领域)发生在DNA水平上突变基因突变基因突变:点突变(singlenucleotidepolymorphysim

SNP)

插入(insertion)和缺失(deletion)突变,Indel●dNt

insertion

or

deletionIndel=3×

dNt

±n×

Aminoacid

=3×

dNt

Framshift

●conversion(取代)transition(转换)

Py

Py

Pu

Pu

transvertion(颠换)

Py

Pu

●conversioneffect

---Samesense

mut.

同义突变（silentmutation沉默突变）GAA(E)→GAG(E)

---Missense

mut.

错义突变GAA(E)→AAA(K)

---Nonsensemut.

无义突变

GAA(E)→TAA(stop)

错义突变包括:致死突变(lethalmutation)渗漏突变(leakymutation)中性突变(neutralmutation)致死突变:渗漏突变:有些错义突变严重影响到蛋白质的活性,甚至完全无活性,而该基因又是必需基因,这种突变往往使突变体致死.有些错义突变的产物仍然有部分活性,使表现型介于完全的突变型和野生型之间的某种中间类型,这样的突变称为渗漏突变.中性突变:有些错义突变不影响或基本上不影响蛋白质的活性,不表现出明显的性状变化,这种突变常称为中性突变.中性突变和同义突变一起称为沉默突变(silentmutation)●突变的表达类型

---获得突变型是遗传学研究的重要前提

---非条件型突变；

alleleinDNAlevel(RFLP,RAPD…)

alleleinphenotype(红花/白花，糯/非糯…)

条件型突变；

突变的表现=突变基因型+诱导条件

（光，温敏感不育，Ts,su--…）

●突变的表达类型

无效突变Nullmutation：完全消除了基因功能的突变（缺失）功能丧失型突变（loss-of-functionmutation）无效突变或其他阻止基因功能的突变

功能获得型突变（gain-of-functionmutation）突变使蛋白质获得新的功能

沉默突变（silentmutation）没有明显表型效应改变的突变

7.2.

突变发生的机理

(自发突变，诱发突变)

7.2.1.自发突变

7.2.1.1碱基异构式引起DNA复制过程的错误

a)碱基异构式

A(amino)A(imino)

C(a)C(i)

G(keto)G(enol)

G(k)

G(e,i)

T(keto)

T(enol-2’)orT(enol-4’)

Nucleotide(Nt)basicunitA(a)A(i)C(a)C(i)G(k)G(e)G(e,i)T(k)T(2’e)T(4’e)碱基异构式引起DNA复制的错配

A(a)

T(k)

G(k)C(a)

正确配对错误配对G(k)

T(e)

A(a)

C(i)

A(i,anti)A(a,syn)A(i,anti)G(k,syn)

G(e,i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)A(a,syn)

A(i)

C(a)

G(e)

T(k)

C(i)

A(a)

T(k)

A(a,anti)

T(k,anti)

C(a,anti)

A(a)

A(a,anti)

碱基异构式引起DNA的错配突变

C(i)C(a)G(k,syn)

G(k,syn)

G(k,anti)G(k)7.2.1.2增变基因（mutatorgene）

w.t.维持遗传的稳定性mut.随机引起其他各类基因的突变与保证DNA稳定遗传相关的基因发生突变后，增加其他基因的突变概率．增变基因类别DNApolymerase相关基因3’

5’editingfunctionmutation错配修复系统的基因MCE(mismatchcorrectionenzyme)DNA

损伤修复系统基因错配修复功能丧失突变率升高修复过程是基因突变的重要来源7.2.1.3不对称交换

DNA分子中大量的重复序列可导致DNA分子发生不对称交换，形成重复和缺失．7.2.2.诱发突变

7.2.2.1.物理诱变

a)电离辐射诱变；

Co60(χ)(γ)ray

Cs137(χ)(γ)ray

H3(α)ray

P32,,S35(β)ray

卫星搭载诱变；

高真空，强辐射，微重力

(χ)(γ)ray穿透性

（外照射处理）

(α)(β)ray非穿透性

（内标记处理）

dNt电荷及结构改变

卫星搭载育种太空蔬菜微重力高辐射强射线b)非电离辐射—UltraVioletlight(U.V)---pyrimidine

dimer(TTdimer)isgeneratedbycovalentlinks

betweenadjacentTT

∧U.V.…CTTA…共价键相邻的两个T之间通过5,6碳位的共价键连接形成环丁基嘧啶二聚体U.V.C

氧化脱氨U7.2.2.2化学诱变a)干扰碱基合成的化学诱变剂6-巯基嘌呤5-氨基尿嘧啶b)碱基类似物5-溴尿嘧啶，2-氨基嘌呤修饰碱基结构的诱变剂HNO2(NitrousacidNA)NH2OH(HA羟胺)NH2OH(HydroxylamineHA羟胺)HNHHOC(a)HAHNHHHOHNHHOC(i)A(a)

NHHOHNHHONH

H羟胺专一性地与胞嘧啶结合，使其转变为羟胺胞嘧啶从而可与Ａ配对将自身活泼的烷基转移到碱基上，导致碱基配对方式改变，或发生脱嘌呤作用,或使得DNA分子发生交联。EMS(Ethylmethanesulfonate甲基磺酸乙脂)CH3—S—O--CH2CH3OOMMS（甲基磺酸甲脂）CH3—S—O--CH3OOSM(SulfurMustardsgas硫芥子气)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl烷化剂d)插入诱变剂AO(AcridineOrange丫啶橙)扁平分子EB(EthidiumBromide溴化乙啶)-ATTTTTCG--TAAAAAGC-DNA复制过程中易于插入AOEB-ATTTCG--TAAAGC-TAO

T-ATEBTTTTCG--TA-ATTTCG--TAAAGC--ATX’TTTTCG--TAXAAAAGC-AAAAGC-对应位置随机插入一脱氧核苷酸摸板链凸起，新生子链缺失部分减基X移码突变限制性片段长度的多型性

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)

testingalleleinDNAelectrophoresispattern基于聚合酶链式反应的多型性

RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)

SSR（simplesequencerepeat）7.2.2.3生物技术定点诱变

基因的定点诱变

oligo-dNt

介导的定点诱变

合成与目标基因某区段互补并含突变位点的oligo-dNt

错配位点不能在3‘-end

renaturation

replicationtwotimes两通用引物（commonP1&commonP2）

设计两突变引物（mut.P1&mut.P2）

第一次两种PCR产物混合，变性，复性

其中一对双链分子不能进行第二次PCR

另一对双链分子的PCR产物为诱变基因

引物重叠延伸的PCR诱变

cP1

mP1mP2cP2

DNAshuffling技术的基因诱变Mutants.Digestionligation

transformationselection插入突变体库的构建定向选择表型鉴定＋AIMS…定向选择表型鉴定＋gfp…转座子介导的突变体库的构建Ti质粒介导的突变体库的构建具有标签的植物突变体

T-DNA-mediatedGenetrap

LB

Genetrap

RB

是经过改造的质粒、转座子载体插入到基因组中使被插入位点正常基因功能丧失，通过载体携带的报告基因的表达及载体的保守序列识别插入位点并分离基因。abcdTi质粒介导的遗传转化GUSassayinriceflowerorgansLeafLeafsheathleafleafleafcollarliguleStemandinternode(茎,节间)FlowerStamen(雄蕊)Pistil(雌蕊)AllflowerorganNoexpressionEmbryo,Endosperm(胚,胚乳)MoretillersSingletillerDwarfYellowleafAlbino(白化)LatefloweringDegenerateinflorescenceBulrush-likecompactpanicleDroughtresistancemutant

OppositegrainpanicleLesionmimicRandomprimerSpecificprimersRandomprimerLBRBIsolateT-DNAflankingsequenceofricegenomeTAIL-PCR突变型鉴定为主的正向遗传学研究定向筛选突变基因为主的反向遗传学研究7.3.保证遗传稳定的机制复制过程中的错配修复DNA的损伤修复基因的回复突变密码的简并致死突变多倍体……7.3.1.复制过程中的错配修复机制(ξ=10-11)DNAmismatch+-----A------

------C---DNApol(ξ=10-8)经第二次校正ξ=10-11MRSMismatchRepairSystem7.3.1.1.MismatchrepairsystemDNApolymerase

ligase

MCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsH,L,Sdamgenem6A甲基化酶Scanning新生链中错配碱基识别新生链中非m6A

的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)

为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATCseq.3’

-------C----------CTAG----------CTAG----5’

5’-----------T----------GATC----------GATC----3’

3’-------------------------------------------------------

5’少梯度多（m6A）新生链MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATC

GATCCTAG

CTAGTCGATC

GATCCTAGCTAGTGATC

GATCCTAGCTAGTACC7.3.1.2.ungsystem(尿嘧啶-N-糖苷酶系统)---TAGC------ATCG------TAGC------A

CG---U---TAGC---ung-aseGCUAU---TAGC------ACG---Apurinase(内切酶)---TAGC------ADNApolligaseTCG---phR471aa7.3.2.DNA的损伤修复7.3.2.1.photoreactivation----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----

Beforereplication&Error-free

400nmBluelight&phRgene

(photo-reactivationenzyme)

可见光激活光复活酶与DNA链上的胸腺嘧啶二聚体结合成复合物，该复合物以某种方式吸收可见光并利用光能切断胸腺嘧啶二聚体之间的两个C-C键．7.3.2.2.Exision—RepairBeforeReplicationError-freeUvrA,B,Cgene

Endonucleases

ExonucleaseDNApol

Ligase切补修复E.coli

存活%U.V计量w.t.UvrA+

RecA+RecA+

uvra-reca-

uvra-7.3.2.3.Recombinative—RepairE.colik12w.t.5003200uvr-a/Rec-A

850Uvr-A/rec-a320uvr-a/rec-a0.21.3存活率为对照（不受紫外线照射处理）37%的U.V.计量Genotype

(尔格/mm2)

TT数量/107

bpRec-A.gene

以某种方式参与DNA损伤修复

存在与重组有关的暗修复机制

与RecA基因引起的strandtransfer有关

TTdimer

未被修复，仅表现为后代群体中TTdimer的浓度的稀释

链的非准确转移，导致突变机率增加TTTTAAAATTTTTTTTAAAATTTT变性TTTTTTAAAAAAReplicationisforcedtoskippastTTdimergapleftinnewlystrand继续复制U.V

Recombinative—Repair(strandtransferrepair)AfterreplicationrepairError-prone

RecA,DNApolymerae

ligasegenesbeneeded链的非准确转移，导致突变机率的增加以保证填补DNA空缺，避免个体死亡为目的7.3.2.4.SOSrepair(U.V.reactivationorWreactivation)JeanWeigleE.coliE.coliE.coliλ

8010100

DamagedDNAofphageberepairedinE.coliASOSrepairinE.colihavetobeinducedbyU.V.(A&B)HighfrequencymutationbySOSrepair(Error-prone)ABCmut.100%50%10%DNAdamaged300XsignalRecAcleavesLexA

SOSUmuDCmutation---Beforeinducing.LexA-p

Rec-A,UmuDC…11genesNeg.repression---U.V.damageDNASignal(S.S.DNAtailor5NtS.S.DNA)机制Baggetal.P.N.A.S.78:5751,1981withaUVof10J/m2.measuredtheumuDCpromoter-β-galactosidaseactivity

cellswiththelacgenesundercontroloftheumuDCpromoter

umuDCpromoterisUV-induciblewithaUVRecA-P;三种功能●DNA重组活性●与S.S.DNA结合活性●少数蛋白的proteinase活性当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）

RecA-p不表现proteinase活性当DNA复制受阻/DNAdamaged能量大量消耗细胞内原少量表达的RecA-p与S.S,DNA结合激活RecA-p的proteinase活性LexA-p降解RecA-p高效表达300timesupSOSopen当DNA复制度过难关后SOSrepair是一种error-prone极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施（正常状态下，SOS是关闭的）RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff7.3.2.5突变的形成DNADNAdamaged/mispairing物理诱变，化学诱变，自发突变未经修复死亡突变率降低经过修复/校正倾向差错修复避免差错修复（重组修复，SOS）形成突变（光修复，切补修复）不形成突变7.3.3.基因的回复突变(backmutation)7.3.3.1.回复突变的概念wildtypemutant(inphenotype)mutation(lowF.)backmutation(verylowF.)7.3.3.2.回复突变的分子机制a)AGC(Ser)

ACC(Thr)

AGC(Ser)b)AGC(Ser)

AGG(Arg)

AGT(Ser)c)AGC(Ser)

AGG(Arg)

AAG(Lys)ifSer≈Lysd)Intragenicsuppression(基因内抑制的回复突变)(基因内第二位点发生突变,使突变的蛋白酶的构型和活性又回复到野生型状态,从而使表型发生回复.)e.g.trp.A---UGG174----------GGA210---(w.t.)(lys)(Gly)backmutation(Cys)

（Gly）----UGG174-----------GGA210--------UGG174----------GGA210--------UGC174-----------GAA210----活性结构无活性结构CA无活性结构

(Lys)(Glu)如何用简单的遗传学方法区分核苷酸水平的回复突变和基因抑制的回复突变?NonsensesuppressortRNA

负载氨基酸与反密码子识读秘密子的功能是彼此独立的TACUAGCGACTAe)Intergenicsuppression—1tRNA基因的反密码子

Missense

suppressorIntergenic

suppression—2AGAUCUGlyArgGlyUCUCCUGGACCUGlyGly(基因间抑制的回复突变)

Intergenicsuppresion-3(多聚体酶类构型的吻合)Subunit-1Subunit-2+ActiveformABabBackmutActiveformB+Inactiveform7.4.基因重组交换的分子机制7.4.1.自然界的DNA分子均是重组体

(recombinant)变异是生物进化的重要因素之一生物对环境的适应机制自然选择的重要基础可遗传的变异；突变（点突变，染色体变异）频率低，突变修复突变压改变群体的基因频率Pn=(1-P0)n遗传重组交换染色体的自由组合染色单体间的交换分子克隆和转基因技术(invitro)普遍发生自然界DNA分子均是重组体7.4.2.遗传重组的类型a)HomologousRecombination

occurbetweenHomo-chromosome/Homo-seq.sister&non-sisterchromatidstransformation(转化),transduction(转导)conjugation(接合),transfection

(转染)…

largefragmentexchange

Recombinationsiteisinhotspotmostly

Recombinasebeneeded(RecA,BC)

b)TranspositionRecombination(replicationrecombination)

Specifictansposablegeneticelement

Independentonhomo-sequencebetween

Tn&targetsite

Transpotasebeneeded

Leadstoinsertion,deletion,inversion,rearrangement…c)Site-DependentSpecificRecombination

Integrase(Int-asebeneeded¬needRecA-p)

Conservativerecombination

attPofλpOp’attBofE.coli

BOB’BOP’POB’Int(Integrase)IHF(Integrationhostfactor)Xis(Excisionase)FIS(factorofinversionstimulation)7.4.3.Homologousrecombination7.4.3.1.前期的两种假说a)Breakage—rejoining(1930Darlington)abABaBAbb)copy-choice(1931Belling)DNAreplicationinSstage?recombinationinMstage?c)Breakage–rejoiningmodel的证据-1E.coligrowinginamediumofC12&N14infectedwithphageofABC&abcABCabcC12N14ABCabc×DNA分子的交换是断裂—错接的过程ABcabCRareRecom.abcabcABCmostC13N15C12N14E.coli

Breakage–rejoiningmodel的证据-2E.coligrowinginamediumofC12&N14infectedwithphageofAB&abABC13N15abC13N15C12N14ABab×AbaBrare亲代DNA分子在复制前就发生了交换DNA分子的交换与复制是两个不同的过程aBAbrareABabAbaBmostE.coli7.4.3.2.同源重组的分子模式Illegitimatesegregation现象基因转换(geneconversion)Neuraspora

A

×aaaAAmeiosisaaAAaAaAWhy?aaAAaAaA2/63/55/34/4A:aAAAAaA

a

AaAAAA

a

Aa

AaAaa

A

aa

Aa

AAA

a

Aaa

A

a

AA

aaa

A

Aaa

Aaaaa

A

A

aa

Aaaaa

Aa

AA

aaaaa

A

a

AA

a基因转换(geneconversion)一条染色体上特定的遗传基因被同源染色体上等位基因所替代的非相互重组的现象

b)同源重组的基本特征

涉及同源染色体的同源序列间的联会配对

涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程

单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号c)同源重组的分子模式1964．Holliday.R

HollidayIntermediate交换发生的相关事件Synapsis;pairedDNAduplexesRecBCD;nicksmadeinhomologousstrandsbetweentwoDNARecA;leadstobrokenendsmoveandcross-overtopairwithcomplementinotherduplex

HollidayIntermediatestructurePQRpqrQ;

A/T

q:

C/GNicksaresealedCross-overpointmovesbybranchmigrationIsomerizationGenerateplanarmolecularbyrotationPQRpqrQ;

A/T

q:

C/G

R,r未交换

Q,q含C/T

结构

R,r发生交换

Q,q含C/T

结构ResolutionintwodirectionsHeteroduplexregionmadeinQ/q(C/T)未校正C/TA/T

Q5

q3

Heteroduplexregionreplicationcorrectandillegitimatesegregation第二条染色单体内C/T的校正可能第一条染色单体内C/T校正可能C/T

A/TC/T

C/G

未校正C/T

A/TC/T

C/G未校正AAAAAACCAACCAACCAAACAACCTTTTTTGGTTGGTTGGTTTGTTGG(6:2)