3.2基因工程的基本操作程序（第二课时）高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第3章3.1重组DNA技术的基本工具本节聚焦1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？【三点提醒】①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。探究•实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。构建基因表达载体（核心工作）1.构建基因表达载体的目的：2.基因表达载体的组成思考：要各个元件有什么作用？（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建——核心步骤02目的基因：主要指编码蛋白质的基因复制原点：DNA复制的起始位点终止子：本质：一段有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的下游功能：终止转录四环素抗性基因、荧光蛋白基因等二、基因表达载体的构建——核心步骤启动子：本质：一段有特殊序列结构的DNA片段位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来（1）二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。（2）表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。⭐注意：载体≠表达载体：目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，并且不能破坏启动子、终止子、复制原点、标记基因⭐启动子与起始密码子相同吗？终止子与终止密码子相同吗？不同启动(终止)转录启动(终止)翻译作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三个相邻碱基本质启动(终止)子启始(终止)密码子DNA片段基因1基因2基因3放大终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子补充：基因的结构转录RNA聚合酶识别和结合位点结束转录mRNA翻译蛋白质原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子1个或2个两个黏性末端（平末端）质粒（载体）DNA分子（含目的基因）获得目的基因，带有两个切口两个黏性末端（平末端）DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同种限制酶（或产生相同末端的限制酶）二、基因表达载体的构建——核心步骤3.构建过程：如果使用一种限制酶进行切割目的基因和质粒，共有几种情况？载体与目的基因反向连接载体与目的基因正向连接目的基因与目的基因之间的连接目的基因自身环化载体自身环化载体与载体之间的连接思考讨论1.只用一种限制酶切割的时候会出现什么现象？（1）自身环化：（2）反向连接：2.如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？质粒重新环化目的基因自身环化质粒与目的基因反向连接双酶切思考讨论3.双酶切时是否能用EcoRⅠ和BamHⅠ？为什么？四环素抗性基因EcoRⅠHindⅢBamHⅠ不能因为BamHⅠ会破坏质粒的抗性基因，无法进行重组DNA筛选。同时BamHⅠ切割位点在目的基因上，也会破坏目的基因。EcoRⅠHindⅢBamHⅠ【核心归纳】图解限制酶的选择原则（1）不破坏目的基因原则；（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则；（3）确保出现相同黏性末端原则。将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞思考常用方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创三、将目的基因导入受体细胞②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法导入外源DNA适用生物：开花植物（1）花粉管通道法（我国独创）三、将目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞★转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。（2）农杆菌转化法三、将目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞（2）农杆菌转化法①农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。（可转移的DNA）②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。三、将目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞原理：方法：①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等，22目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达三、将目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞过程：（2）农杆菌转化法1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？

得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养三、将目的基因导入受体细胞该过程经过____次拼接、____次导入①第一次拼接：_______________________________②第二次拼接：______________________________________________________________③第一次导入：__________________________________④第二次导入：__________________________________将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上

农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）两两将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）拓展—拼接&导入03（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵①体积大，易操作。②易表现出全能性。（3)过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物三、将目的基因导入受体细胞2.目的基因导入动物细胞原核细胞（常选择大肠杆菌）（1）受体细胞：优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。（2）常用方法：Ca2+处理增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。Ca2+感受态细胞吸收三、将目的基因导入受体细胞3.目的基因导入微生物细胞小结：将目的基因导入受体细胞的方法种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法

受体细胞

转化过程目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法体细胞或受精卵受精卵原核细胞当堂巩固1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。（）（2）构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（）（3）只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。（）××√将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？思考不一定！检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。

在抗虫棉的培育过程中，目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道Bt基因mRNABt抗虫蛋白抗虫棉PCR等技术检测抗原—抗体杂交技术分子水平抗虫鉴定（个体水平）四、目的基因的检测与鉴定概念（1）借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传（2）基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。（3）核酸杂交：可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。检测内容及方法:（一）分子水平的检测检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因①检测目的基因是否导入——通过PCR等技术检测提取棉花细胞DNA用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增对扩增产物进行检测四、目的基因的检测与鉴定基本思路：①制作基因探针，并用PCR扩增；②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。探针与受体中的DNA分子杂交出现杂交带：不出现杂交带：已插入未插入提取棉花细胞DNA用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增对扩增产物进行检测方法2：检测目的基因是否导入——DNA分子交杂技术变性1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针；2、使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，则导入成功。原理：碱基互补配对原则检测Bt基因是否翻译出mRNA提取棉花细胞mRNA逆转录产生DNA对扩增产物进行检测用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增②检测目的基因是否转录——通过PCR等技术检测（一）分子水平的检测如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白从棉花中提取蛋白质用相应抗体进行抗原-抗体杂交检测③检测目的基因是否翻译——通过抗原-抗体杂交检测四、目的基因的检测与鉴定方法2：检测目的基因是否转录——分子杂交技术1、制作基因探针；2、探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了mRNA。变性探针15N15N转基因生物的mRNA杂交分子（可检测）原理：碱基互补配对原则③检测目的基因是否翻译——通过抗原-抗体杂交检测从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白抗原抗体杂交脱分化检测目的基因是否表现出相应的性状检测抗虫棉是否具有抗虫性状采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况（二）个体水平的检测四、目的基因的检测与鉴定转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等个体水平检测：抗性以及抗性程度一、概念检测练习与应用1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒