《一例罗氏沼虾螺原体病的诊断与防治研究》5600字（论文）

32一例罗氏沼虾螺原体病的诊断与防治研究摘要：罗氏沼虾有着“淡水虾王”之称。世界上养殖罗氏沼虾的区域主要有中国及东南亚的一些国家，。2000以来，中国养殖罗氏沼虾的规模不断扩大，产量显著增加。但随着水域环境不断变差，一些危害罗氏沼虾的疾病已悄然流行。本文以扬州市某罗氏沼虾养殖基地爆发的疫病为例，通过临床诊断和实验室检测等手段，最终将此次疫病确定为罗氏沼虾螺原体病，并提供防控措施，进而为罗氏沼虾养殖业提供具有实际价值的螺原体病诊断和防控方法，减少损失。关键词：罗氏沼虾；螺原体；诊断；防治。摘要 6关键词 6综述 81螺原体简介 81.1螺原体特点 81.2柔膜纲生物致病原理 822罗氏沼虾养殖现状及螺原体病的发现 92.1罗氏沼虾养殖现状 92.2颤抖病及罗氏沼虾螺原体病的发现 10正文 101发病情况及病理特征 111.1发病情况 111.2病虾症状 112实验室诊断 112.1材料 112.1.1试剂配制 112.1.2实验动物 112.2方法 112.2.1PCR检测 122.2.2电镜观察 122.3结果 122.3.1病虾超微结构观察 122.3.2PCR检测结果 123病因分析 133.1饲料营养不均衡或营养过剩 133.2抗生素和激素 143.3水质因素 144防治 144.1预防 144.2治疗 154.2.1药敏试验 154.2.2治疗措施 154.3防控效果 155结语 16参考文献 16综述1螺原体简介1.1螺原体特点螺原体属于原核生物，上个世纪70年代它们首次在植物和昆虫体内发现，部分具有致病性。螺原体属于厚壁菌门、柔膜体纲、虫原体目、螺原体科、螺原体属，主要具有以下几个特性：（1）螺旋性。在指数生长期呈现明显的螺旋状形态。（2）没有细胞壁。它的最外层是由蛋白质和脂质构成的3层结构的细胞膜。除了中间层是脂质外，其他是蛋白质层。（3）运动性。螺原体因为其具有能够附着在宿主细胞体表上的特殊上层结构所以能够进行旋转和伸缩运动（4）过滤性。螺原体直径为0.1-0.2μm，长度为3-5μm。螺原体缺少细胞壁这一结构，因此其形态并非是固定的，可以通过0.22μm的滤膜。1.2柔膜纲生物致病原理螺原体属于柔膜纲生物，其生物学特性和致病原理与支原体相近，所以了解和熟悉柔膜纲微生物的致病性具有必要性。柔膜体纲的宿主包括哺乳类、爬行类、鸟类、鱼类等。宿主生长环境种类繁多，包括陆生及水生。虽然有不少支原体可以在静水中生活，但大多数都存在于人和动物的消化道，是导致疾病的原因。支原体对感染对象的损伤及作用体现在以下几个方面：（1）附着在感染对象的细胞表面，妨碍细胞膜表面受体的正常活动，使得细胞受到严重损害。（2）支原体由于内部无细胞壁，与感染对象的细胞直接接触或融合，从而可能引起其细胞损伤。（3）支原体几乎不具备合成氨基酸、脂肪酸、维生素的能力，所以其生物大分子的合成需要来自宿主的营养，导致宿主细胞功能遭到损害。（4）支原体能释放有毒酶类，从而导致宿主细胞发生病变。（5）支原体感染细胞后，会诱导免疫细胞产生TNF-a、Y-干扰素、IL-8等炎性因子，它们会诱导炎性细胞渗出，之后便导致炎症失去控制，继而加重细胞损伤，最终诱发细胞凋亡。支原体和螺原体同属柔膜体纲，可由支原体的致病性研究推断，黏附是支原体类生物入侵宿主的第一步，也是其是否能寄生和感染宿主的关键一步。柔膜体纲生物缺少细胞壁这一结构，但其表面都有一个特殊的尖端结构，据研究表明，此结构在维持细菌的形状结构、细胞分裂、运动等方面起着重要作用。据相关报道，当支原体突变体丧失其黏附功能后，其感染力大大降低。而当其突变体经过处理恢复黏附能力后，其感染力又随之恢复。22罗氏沼虾养殖现状及螺原体病的发现2.1罗氏沼虾养殖现状罗氏沼虾产自东南亚，它生长周期短、营养成分高，可生活在淡水和咸水中。该品种于20世纪70年代引进我国，目前已在多个省、市、自治区进行养殖（图1-1）。罗氏沼虾外观主要颜色为青色。腹部有6对附肢，尾巴附肢退化作尾扇。头胸部较粗壮，自腹部向后逐渐变细，头部分为6段，胸部8段，有外壳包围，腹部7段，每段皆有一壳包围。附肢每段一对，由头部到尾部分别为触角、颚、颚足、步足、游泳足、尾扇。罗氏沼虾雄性成虾体格大于雌性，雄虾长达40厘米，重0.6千克，且第二步足较大，呈现蓝色；雌性个体长25厘米，重0.2千克。（图1-2）2.2颤抖病及罗氏沼虾螺原体病的发现中华绒螯蟹在我国被广泛养殖，病害越来越多，“颤抖病”屡见不鲜。颤抖病于上个世纪90年代首次在江苏发现，随之又相继在上海、浙江等地出现。发病最后阶段中华绒螯蟹会出现附肢颤抖症状，所以被称为“颤抖病”，也叫“环爪病”。该病发病率达到60%以上，且在不断增长。从上世纪90年代开始，王文等人对中华绒螯蟹颤抖病病原进行了探究。通过光镜及显微镜观察以及对病原学、病理学的研究，确定河蟹患颤抖病的病因是感染了类立克次氏体。从死蟹体内分离出病原菌后，加以纯化，并对其进行人工培养，便获得纯培养的菌株，通过对纯培养的病原菌进行16sRNA基因的克隆和BLAST同源性检索，通过比对分析发现此致病菌与螺原体有98%左右的相似性，因此判断病原为螺原体类微生物。随后，王文等人对健康的中华绒螯蟹用纯培养的螺原体进行了人工注射回感实验。在28℃条件下，中华绒螯蟹在接受螺原体注射后，河蟹在半个月左右出现了患病特征，不久便死亡，对死蟹的血淋巴抽样检测，在其中发现螺原体，证明导致中华绒螯蟹出现颤抖症状的原因是遭受了螺原体侵染。2010年，江苏高邮市爆发严重的罗氏沼虾疾病，大量罗氏沼虾死亡。病虾症状为：缺乏活力，体节断裂，鳃发黄，摄食量较少。王文课题组通过微生物学和病理学鉴定以及柯赫氏法则人工注射回感实验的进行，最终确定导致此次罗氏沼虾发病死亡的是螺原体。这是第一次发现螺原体也能感染罗氏沼虾，罗氏沼虾成为了螺原体又一个水生动物宿主。罗氏沼虾螺原体的发现和分离鉴定，再次扩大了螺原体的宿主范围，对螺原体研究以及其与宿主的关系具有里程碑的意义。结合以上研究，螺原体在水生甲壳动物中的宿主范围正逐步扩大，螺原体对水产养殖行业的威胁正逐渐加剧，加快对水生螺原体的致病性研究和防控措施迫在眉睫。正文2018年某虾塘面积5.5亩。6月中旬发现部分罗氏沼虾死亡，7月初罗氏沼虾死亡数量开始增加，死亡数量增至20-30只每天，经检测病虾感染螺原体。该塘连续几天检测底层溶氧都是1.2mg/L左右，另外之前杀过蓝藻，罗氏沼虾活力差，鳃发黄。经过临床诊断和实验诊断确诊为螺原体病。1发病情况及病理特征1.1发病情况高邮地区是罗氏沼虾养殖的集中区域，主要采用在池塘内挖塘搭建温棚，前期对大棚进行锅炉烧水加温，到四月份天气晴好，水温达23-24度时，不再烧锅炉加温，养殖到五月中旬时，撤去大棚。每年三月中旬投放约6万尾虾苗，等到四月中旬再投放4万尾。也就是每亩放苗量在十万尾左右。等到6月下旬或7月初开始捕捞体长6厘米以上的成虾，体长未达标的幼虾及壳较软的罗氏沼虾放回塘中继续养，10日之后再次捕捞，如此过程重复多次，直至本年度养殖结束。该池塘在养殖中后期，发病塘口从7月份开始，出现少数罗氏沼虾死亡现象。初期没有此现象，发病时水温在30℃左右，底层溶解氧1.2mg/L,氨氮0.8mg/L，亚硝酸盐0.341mg/L，池塘透明度30cm左右1.2病虾症状多数病虾游动无力。死亡的以6cm以上的成年罗氏沼虾为主。死虾肉质肥满，外壳较软。肉眼观察病虾，虾体体表有溃疡现象，体节断裂，附肢发红，鳃发黄，少数病虾腹部肌肉发白。剖检发现病虾肝脏受损，甚至有糜烂现象。2实验室诊断2.1材料2.1.1试剂配制（1）4%戊二醛固定液8mL50%戊二醛加双蒸水至50ml,摇晃均匀，再加50mlPBS，混匀即得4%戊二醛固定液，4℃存放。（2）2%磷钨酸钠溶液称取0.4g磷钨酸钠粉末，加双蒸水定容至20Ml,之后使用1mlNAOH将ph调至6.8-7.0。2.1.2实验动物病虾来自高邮市某养殖塘；健康罗氏沼虾2.2方法2.2.1PCR检测将病虾用75%的酒精整体消毒，取其肌肉组织约0.3克，用Chelex-100方法提取总DNA，并用螺原体特异性引物（R5：5’AGCACCGAACTTACTCCGACAC3’;5’CGCACACGGTTTAGCAAGTTTGGG3’）进行PCR检测。（1）PCR体系：25μl10XBuffer2.5μldNTP2μl螺原体特异引物1μl+1μlTaq酶0.2μl模板1μlDdH2O17.3μl（2）PCR扩增的反应条件：96℃预变性2分钟，94℃变性1分钟，65℃退火50秒，72℃延伸1.5分钟，30轮循环后，72℃延伸10分钟，4℃10分钟。（3）取5μlPCR产物用于1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。2.2.2电镜观察抽取病虾0.1毫升血液，与4%戊二醛等体积混合，在4℃条件下固定两小时。取10μl滴于聚醋酸甲基乙烯脂包被的铜网上，1分钟之后用滤纸吸去液体，然后滴上10μl2%磷钨酸钠负染10-15s，再用滤纸吸去液体。待铜网干燥后用透射电镜观察。2.3结果2.3.1病虾超微结构观察从病虾抽取的血淋巴经过负染后，电镜观察可见大量聚集的螺原体病原，呈现螺旋状特征和典型的顶端结构。（图2-1）通过电镜观察发现病虾组织损伤严重，表现为全身性感染，感染组织包括血淋巴细胞以及所取其他器官的结缔组织。在血淋巴细胞内观察到大量螺原体富集形成的包涵体。（图2-2）2.3.2PCR检测结果从病虾提取DNA，并用螺原体特异性引物F28/R5扩增目的片段，PCR扩增产物检测结果见（图2-4）。选取3只发病罗氏沼虾用于检测螺原体，目的条带大小为271bp，结果为阳性，表明病虾感染了螺原体

Mi：线粒体Mi：线粒体图2-3PCR检测结果，引物为螺原体特异性引物F28/R5。LaneM:DL2000,Lane1-3;患病罗氏沼虾，Lane4:阳性对照，Lane5:阴性对照，Lane6:空白对照。 3病因分析3.1饲料营养不均衡或营养过剩罗氏沼虾是热带品种，其生长过程受温度影响。结合江苏扬州的气候条件，罗氏沼虾全年养殖时间从3月份到10月份。为了尽量在最有效时间内将虾上市，配合饲料起着至关重要的作用。为达目的，饲料中营养指标常常超出罗氏沼虾生长所需营养。以至于饲料中的蛋白质、脂肪等不能被罗氏沼虾机体完全消化吸收，它们在罗氏沼虾肝胰脏等组织积累，最终导致脂肪肝，甚至至会引起肝胰脏的病变。3.2抗生素和激素为了收缩罗氏沼虾养殖周期，增加养殖产量，有些养殖者在养殖罗氏沼虾的过程中频繁使用某些抗生素药物，如罗红霉素等。部分饲料厂在饲料中过过量添加促生长剂，导致罗氏沼虾肝脏功能异常，排毒功能减弱，虾抗病性下降。3.3水质因素高邮罗氏沼虾养殖密度在每亩10万尾左右。投喂量逐渐增大的后期，虾塘水质和底部环境恶化，水体表面颜色不正常，水质中氨氮、亚硝酸盐等超标，底不淤泥发黑并有恶臭，水体缺氧等，会导致虾死亡率上升。4防治遵循以防为主、防治结合、防重于治的原则，采取适当的综合措施及时进行防控。4.1预防“养虾先养水，养水先养底”，池底环境及水质情况对于罗氏沼虾养殖的成败起着关键作用。具体措施（1）选用活力强，体长在2-3厘米的虾苗，个体差异不明显，能够在微流水中逆向游动。且虾苗必须经过病毒检测，确定未携带病毒后，方可进行养殖。（2）放苗前使用高锰酸钾100毫克/升，浸浴罗氏沼虾苗种5-10分钟。（3）在释放幼苗前彻底清塘，并让塘底完全暴露在阳光下。将生石灰泼洒全池。用于放养罗氏沼虾的池塘，都需要在冬季进行一次干池修整，清除淤泥，平整池底，修理塘基。（4）定时、定点、定量投喂优质饵料，每天投饲量一般为存塘虾总重量的10%-20%，随虾体重的增加而渐渐降低。每个水池设置约4个料台，投饵两小时后查看各料台吃料情况，以饲料略有残余为好，不然就要更动次日的投喂饲料数量。（5）多开增氧机，多增氧，尤其是发病高峰期或高温天气。（6）定期检测池水水质指标，PH要不低于7.5，不高于8.5，溶氧在每升5毫克以上，氨氮不高于0.4mg/L亚硝酸盐不高于0.05mg/L（7）定期使光和细菌、芽孢杆菌等动保产品调水。（8）定期投喂VC等水产动物保健药品，增强罗氏沼虾免疫能力。（9）使用以磺胺甲基戊唑等能够抑制螺原体生长的药物进行预防。最初用药时，将药物与饵料混合，每10千克饲料添加药物5克，连续用药5天。（10）定期使用二溴海因、溴氯海因等水体消毒剂，抑制病毒传染。（11）定期对罗氏沼虾进行病毒检测，防治互相感染。（12）对塘口的工作用具进行药物消毒处理。4.2治疗4.2.1药敏试验对各种抗生素进行药敏试验，结果如下表4-1各种抗生素对罗氏沼虾螺原体的抑制情况抗生素种类螺原体抗生素种类螺原体干扰细胞壁合成头孢西丁—影响蛋白质合成米诺环素++万古霉素—四环素++青霉素—克林霉素++氨苄西林—卡那霉素+多粘菌素B—克拉霉素++苯唑西林—链霉素—氨曲南—庆大霉素+阻止细菌的DNA合成诺氟沙星++麦迪霉素++左氟沙星++大观霉素+氧氟沙星++妥布霉素+影响核酸合成复方新诺明—其他呋喃妥因++++表示高度抑制，+表示中度抑制，—为不抑制药敏实验结果表明，诺氟沙星、左氟沙星、四环素等可较大程度抑制罗氏沼虾螺原体的生长。阻止细菌DNA合成的抗生素对螺原体高度抑制。4.2.2治疗措施具体措施：（1）及时捞出池中病虾（3）加大增氧（2）控料，适当减少投喂，降低罗氏沼虾肝脏负担。（3）减少用药刺激，如杀虫、杀蓝藻等药物的使用。（4）发病虾池用0.3mg/L三氯异氰脲酸全塘泼洒，隔天用1次，连续使用3次。（5）土霉素拌料投喂，用量0.5-1g/kg，连续用药一星期，高温天气，一个疗程结束半个月后再用一次药。4.3防控效果通过实施一系列的治疗措施，经过一个疗程过后，罗氏沼虾发病率和死亡率有所下降，螺原体病疫情得到基本控制5结语1养殖场爆发的疫情是由螺原体引起，炎热的高温天气及较差的水质环境是导致螺原体病发生的主要原因。2防范螺原体病的关键得从罗氏沼虾体质和