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文档简介
中国兽医协会发布I1猫白血病病毒核酸检测方法本文件适用于猫白血病病毒感染猫的血液中病毒核NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范4缩略语FeLV：猫白血病病毒（FelineleukaemiaviruRT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymeraTaq酶：耐热DNA聚合酶（ThermusAquaticusPolyme5.1仪器25.2耗材脉采集200~300μL血液。样品编号并填写相应采样单，样品尽快送检，送检时检测的样本置于-70℃或以下保存，如无3R取6.4.1步骤反转录的cDNA，进行PCR扩增检测，PCR反应体系及参数见附加样：分别取10μLDNAMarker、PCR扩增产物、阴阴性对照：PCR产物无核酸和在实验有效的前提下，被检样品的PCR产物电泳后在44配备荧光定量PCR扩增试剂，根据被检样品数量，按照推荐的反应液配方（见附录C.2）配制反应），到20μL，同时设立阴阳性对照孔，记录反应管对应的样品编合的检测通道读取荧光信号值，淬灭基团选择none。推荐的荧可疑5试剂配方称量Tris24.2g，Na2EDTA·2H2O3.72g于1L烧杯中。向烧杯中加入约600mL无菌蒸馏水，充分搅称量Tris54.0g，EDTA2.9mg于1L烧杯中。向烧加入硼酸27.5g，充分搅拌；加无菌蒸馏水定容至1L后，室温保存。使用时稀释5倍即1×TBE。A.3核酸凝胶制备6引物序列5’-3’工作液终浓度(µmol/L）体积(µL）\Pol_R\2\7\117引物序列5’-3’FAM-CCAGCAGTCTCCAGGCTCCCCA-BH终浓度(µmol/L）体积(µL）\酶\\2\\118D.1FeLVPCR阳性对照质粒序列（GenD.2FeLV荧光PCR阳性对照质粒序列（GenB5’-AACAGCAGAAGTTTTCAAGGCCGCTAC按照D.1和D.2中的序列合成基因片段，分别克隆至pMD19-T载体，再转化至DH5α感受态细胞，分别构建FeLVPCR和荧光PCR阳性对照重组质粒，提取重组质粒进行PCR检测和测序分析，结果正确的为阳性重组质粒。利用超微量分光光度计测定阳性重组质粒浓度，并将浓度换算成拷贝数（DNA拷照母液。将阳性
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