动物细胞工程课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第2章细胞工程第2节动物细胞工程课标要求学习目标[课标内容]1.阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织,分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物细胞培养是动物细胞工程的基础2.简述于细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值3.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段,使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。4.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术5.阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中,并使重组细胞发育与概括等科学思维的习惯。成新胚胎,继而发育成动物个体的过程。[核心素养]生命观念：认同动物细胞培养是动物细胞工程的基础；基于两个动物细胞能够融合的事实,阐明动物细胞融合的概念及需要的条件；基于对高产奶牛体细胞核移植技术过程的理解阐明动物体细胞核移植的概念,认识到生命的发生、发展过程科学思维：基于对动物细胞培养条件的理解,形成分析与比较的科学思维；通过比较动物细胞融合与植物体细胞杂交技术的异同,培养分析与比较的科学思维；通过分析动物体细胞核移植技术原理,养成归纳一个去核的卵母细胞中,并使重组细胞发育与概括等科学思维的习惯科学探究：通过对动物细胞培养的实际操作,培养科学探究的能力；基于对动物细胞融合的理解，阐明单克隆抗体的培育、操作过程,形成积极交流和讨论的能力；通过对动物体细胞核移植过程的交流与讨论,增强在探究中勇于探索的精神社会责任：通过对干细胞特性的理解,形成能用干细胞解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥反应的生活实际问题；基于对单克隆抗体在医学方面应用的理解，形成热爱生命、热爱科学的意识；能够对动物体细胞核移植技术的应用前景作出理性判断,形成崇尚科学的意识[学习目标]1.阐明动物细胞培养的条件和过程。2.简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。3.阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程，认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值。4.阐明利用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和该技术的应用前景[学习重点]1.动物细胞培养的条件和过程。2.干细胞在生物医学工程中的应用。3.单克隆抗体的制备和应用4.用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程[学习难点]1.单克隆抗体的制备过程2.用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程课题：动物细胞工程动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞培养技术动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合等

是其他动物细胞工程技术的基础问题探讨动物细胞培养的过程动物细胞培养的条件干细胞培养及其应用动物细胞融合技术单克隆抗体及其应用体细胞核移植过程体细胞核移植技术的应用前景及其存在的问题问题一

？动物细胞培养1.动物细胞培养(1)概念从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞，然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖的技术。原理：

幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更易于培养？为什么？细胞增殖处理方法：幼龄动物的细胞和分化程度低的细胞更易培养原因是这些细胞分裂能力强。原因：机械法剪碎胰蛋白酶处理靠在一起限制生长增殖分散成后，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出条件：(2)动物细胞培养条件体内由内环境提供，机体内稳态调节保障体外，人工模拟提供类似的条件营养：糖类、氨基酸、无机盐、维生素……无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境1.动物细胞培养(2)动物细胞培养条件营养：糖类、氨基酸、无机盐、维生素……无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境1.动物细胞培养培养基的构成：+合成培养基血清等天然成分将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质。液体培养，细胞更容易获取营养、O2等(2)动物细胞培养条件营养：糖类、氨基酸、无机盐、维生素……无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境1.动物细胞培养①适宜的温度：哺乳动物细胞培养的温度多以___________为宜；②适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为________；③适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。36.5±0.5℃7.2-7.4①培养液、培养用具：灭菌处理；②在无菌环境下进行操作；做法：目的：目的：①防止微生物竞争营养②防止微生物产生有害物质杀死细胞定期更换培养液以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害也可以培养液中加入抗生素种类、浓度营养：糖类、氨基酸、无机盐、维生素……无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境(2)动物细胞培养条件1.动物细胞培养95%空气

+

5%CO2的CO2培养箱CO2培养箱维持培养液的pH5%CO2

O2：细胞代谢所必需培养皿松盖培养瓶培养容器：[思考]动物细胞培养液的主要成分是什么？

较植物组培培养基有何独特之处？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基

2、成分中有动物血清等

（不用激素）不进行生长发育取材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官制成细胞悬浮液胰蛋白酶、胶原蛋白酶加培养液动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。理由：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养处理时间适宜,过长会破坏细胞结构蛋白(3)动物细胞培养的过程1.动物细胞培养靠在一起限制生长增殖（剪碎）分散成单个细胞（分解弹性纤维蛋白）要求瓶壁光滑,无菌,易贴附.培养皿或松口培养瓶(3)动物细胞培养的过程现象：少数可以悬浮在培养液中生长增殖

绝大多数贴附于某些基质表面（表现为细胞贴壁生长）细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称之为细胞贴壁1.动物细胞培养分裂增殖受抑制的因素（P44）

①悬浮的细胞——密度大、有害物质积累、营养物质缺乏

②贴壁的细胞——密度大、有害物质积累、营养物质缺乏、接触性抑制当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，会停止分裂增殖，叫接触抑制更换培养基，分瓶传代培养细胞贴壁过程取材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官制成细胞悬浮液胰蛋白酶、胶原蛋白酶分瓶原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。理由：细胞分化程度低，增殖能力强，分裂旺盛，容易培养特点：大多数贴壁生长和接触抑制处理时间适宜,过长会破坏细胞结构蛋白要求瓶壁光滑,无菌,易贴附.10代细胞失去贴壁生长和接触抑制特性，成为不死癌细胞系(3)动物细胞培养的过程1.动物细胞培养靠在一起限制生长增殖（剪碎）酶处理再离心分散成单个细胞（分解弹性纤维蛋白）离心或收集细胞：悬浮生长类：直接用离心法收集贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。①为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？②如何将动物组织分散成单个的细胞呢？a.成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖b.有利于细胞获取营养、排除代谢废物先用剪刀剪碎,后用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理③细胞膜的主要成份是什么？胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？蛋白质和磷脂能那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？注意时间的控制【思考】④能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？不能，因为酶的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近⑤动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂能力强，分裂旺盛、易培养⑥动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？⑦培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？体现了细胞膜的什么功能？⑨如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？易于培养细胞贴壁，进行生长增殖①当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，即接触抑制。②同时受密度大、代谢废物积累、营养匮乏的限制将贴壁的细胞用胰蛋白酶等处理，然后继续增殖。⑧有些细胞为何能一直传下去吗？癌变，遗传物质改变了【思考】细胞间信息交流[思维拓展]①动物胚胎或幼龄动物的器官或组织的原因：

细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养（植物也取幼嫩组织细胞，原因：分化程度低、分裂能力强、全能性高）（体外细胞具有接触抑制特性）另外，便于接触吸收营养物质、排出代谢废物方法：先剪碎、再胰蛋白酶处理（受PH影响不能用胃蛋白酶）②分离细胞的原因：成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖[思维拓展]③胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理的原因：动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。④培养基为液体，培养瓶要求瓶壁光滑,无菌（易贴附）⑤细胞的分裂方式：有丝分裂⑥50代以上细胞之所以不死，是基因突变的结果⑦由于能保持正常的核型,所以动物细胞工程中保存或使用的细胞多为10代内的原代和传代细胞（以后的50代内传代尽管遗传物质不变，但核型不稳定；50代后癌变失去贴壁生长、接触抑制特性）（遗传物质发生了变化，细胞表面的糖蛋白减少，也没有贴壁生长和接触抑制的特性），已成为癌细胞[思维拓展]⑧植物细胞和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养理论基础植物细胞的全能性细胞增殖前处理无菌、离体无菌；用胰蛋白酶处理，使组织细胞相互分散取材植物较幼嫩的部位或花药等（分化程度低，分裂能力强，全能性高（为了得到完整生物体））动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织（分化程度低分裂能力强（为了得到大量细胞））培养基性质固体液体培养基成分水、矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素、琼脂等糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素、动物血清等结果最终产生新个体（体现了细胞的全能性）不形成新个体（不能体现细胞的全能性）用途①快速繁殖②培养无病毒植株③突变体的利用等育种④细胞产物工厂化生产获得细胞或细胞产物相同点①都需无菌操作；②都需要适宜的温度、pH等条件；③都进行有丝分裂，属于无性繁殖（保持遗传稳定）没有脱分化再分化过程[视野拓展]动物细胞培养的应用（了解）①用于生物制品的大规模生产（病毒疫苗、单克隆抗体、干扰素）;②用于动物细胞工程中受体细胞的培养;③用于有毒物质的检测;④用于生理,病理和药理的研究（与病变细胞比对）;⑤是其他动物细胞工程技术的基础.【应用实例】动物细胞培养如何检测有毒物质毒性的大小？[提示]用含有一定浓度有毒物质的细胞培养液和正常细胞培养液同时培养正常细胞，通过对照观察畸变或死亡细胞的百分数来确定其毒性强弱。1.小鼠的某种上皮细胞与某种淋巴细胞体外培养时，细胞周期基本相同，但上皮细胞在培养时，呈现扁平不规则多角形，且贴附在培养瓶内壁上；而该淋巴细胞则常常悬浮在培养液中。下列有关叙述正确的是

()A.需将细胞置于含有95%O2和5%CO2的培养箱中培养B.对这两种动物细胞培养时，可用胰蛋白酶或胃蛋白酶分散细胞C.培养消化道上皮细胞更易观察判断细胞是否具有接触抑制现象D.传代培养时对这两类细胞的处理方式是相同的C2.如图所示是某动物细胞培养时，培养液中活细胞和死细胞密度统计结果，下列相关叙述错误的是

()A.实验中要控制胰蛋白酶溶液浓度和处理时间，以免损伤细胞B.培养液中应适当加入青霉素、链霉素，以避免杂菌污染C.曲线bc段变化的主要原因是培养液中营养物质不足及有害代谢物积累等D.培养至第6d时，新产生的细胞数等于死细胞数D干细胞技术带来延长生命的可能

干细胞培养及其应用问题二

？2.干细胞培养及其应用干细胞：动物和人体内仍保留着少数具有分裂和分化能力的细胞（是一类未分化或未完成分化的细胞）分布：早期胚胎、骨髓和脐带血等组织器官中种类：胚胎干细胞、成体干细胞等在一定条件下，可以分化成其他类型细胞分化的渐变性胚胎干细胞ES细胞分布特点应用实例局限性早期胚胎中具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。成体干细胞分布举例特点应用实例成体组织或器官内造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）神经干细胞（神经系统中）精原干细胞（睾丸中）具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病造血干细胞

→神经干细胞→治疗细胞损伤造成的疾病诱导多能干细胞概念制备方法优点应用通过体外诱导成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞可治疗镰状细胞贫血症；在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展①诱导过程无须破坏胚胎；②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。①将特定基因导入细胞

（P98T2）

③用小分子化合物诱导形成iPS细胞②将特定蛋白导入细胞优于胚胎干细胞[视野拓展]①干细胞用途（能判断、举例）a治疗人类的某些顽症b培育出人造组织器官，用于器官移植c是研究体外细胞分化、凋亡机理的理想材料②干细胞特点：（了解不要求）a.形态：体积小、细胞核大、核仁明显。

b.功能：具有发育的全能性

（可分化为成年动物体内任何一种组织细胞，需要分化诱导）c.在体外培养的条件下，ES细胞可以增殖而不发生分化

（需要抑制因子或用饲养层培养）另外，对它可以进行冷冻保存，建立iPS细胞库，也可以进行遗传改造。P47拓展应用回归情境新冠肺炎重症患者有可能会出现肺部不可逆的纤维化，对于这种病人，肺移植是唯一可行的治疗手段，对降低死亡率有较大意义。肺移植的手术难度很高，而且肺的合适供体很难找，手术以后器官还容易出现免疫排斥反应，请应用本节所学的知识，思考有什么解决办法？取成纤维细胞转入相关因子细胞转化为iPS细胞诱导iPS细胞定向分化为特定组织器官移植回病人体内3问题三

？动物细胞融合技术实验：人——鼠细胞荧光标记融合实验该实验说明：细胞膜具有流动性红色荧光染料标记膜蛋白绿色荧光染料标记膜蛋白

回顾旧知3.动物细胞融合技术(1)概念也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞（单核）的过程（自然融合：受精）(2)原理：细胞膜的流动性、细胞增殖(4)诱导方法：物理法（电融合法）化学法（PEG融合法）生物法（灭活的病毒

(动物细胞融合特有)）会经过膜融合、质融合、核融合过程(3)优点：克服远缘杂交不亲和（打破生殖隔离限制）P49旁栏思考实例生物法（灭活的病毒(动物细胞融合特有)

）灭活是指用物理或化学方法使病毒失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。灭活的病毒诱导细胞融合的原理：

病毒表面糖蛋白和一些酶与细胞表面糖蛋白发生作用，使细胞相互凝聚，膜流动性加大，细胞膜上的蛋白质、脂分子重新排布，细胞膜融合。资料119世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。肺结核病人病理切片3.动物细胞融合技术(5)过程[思维拓展]类似植物细胞，也得到了三种两两融合的AA、AB、BB细胞，以及多细胞融合结果，还有不融合的，需要筛选出AB杂交细胞思考：这样得到的只有杂种细胞吗？会经过膜融合、质融合、核融合过程，核融合（完成标志）取材若为组织块，先用酶处理成单个细胞[思维拓展]植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞增殖细胞融合过程用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞后，诱导细胞融合诱导融合手段①物理法：离心法、电融合法等；②化学法：PEG融合法、

高Ca2+-高PH融合法①物理法：电融合；②化学法：PEG融合法③生物法：灭活的病毒结果获得杂种植株获得杂种细胞，以生产细胞产品用途克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍获杂种植株制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等意义打破生殖隔离屏障，实现远源杂交3.动物细胞融合技术(6)细胞融合技术的意义打破生殖隔离限制，使远缘杂交成为可能；（动植物）成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤（动物）培育生物新品种的重要手段（植物）(7)重要用途实例：制备单克隆抗体4问题四

？单克隆抗体及其应用4.单克隆抗体及其应用【思考】①抗体由何种细胞产生？一个该细胞能分泌多种抗体吗？

②抗体主要分布在哪里？传统抗体的获得：向动物体内反复注射某种抗原，然

后从动物血清中分离所需要的抗体。传统血清抗体的制备的缺陷：产量低、纯度低；特异性差、反应不够灵敏一个B淋巴细胞单克隆抗体细胞群抗体克隆设想1：4.单克隆抗体及其应用构建兼具分泌单一抗体和无限增殖大量生产的遗传特性的细胞即：设计方案：一个B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体）骨髓瘤细胞能无限增殖产生的抗体性质单一（纯度高）、特异性强、灵敏度高细胞无限增殖，细胞产物量大利用融合细胞的优点设想2：不增殖，难克隆4.单克隆抗体及其应用(1)概念由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。(2)制备原理

①一个B淋巴细胞(浆细胞)只能产生单一抗体;

②骨髓瘤细胞能无限增殖的特性;★③利用动物细胞融合技术获得既能产生单一抗体又能无限增殖的的杂交瘤细胞.（具有双亲性状）

④利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,获得大量单克隆抗体.①化学性质单一、纯度高；②能准确识别抗原细微差异，与特定抗原发生特异性结合；

（或答“特异性强、反应灵敏度高”）③可大量制备

理论上理解为“单个B淋巴细胞”，基于技术操作，实际上是指“筛选后的单个杂交瘤细胞的克隆和生产”(3)优点：（P50）诱导融合4.单克隆抗体及其应用(4)制备过程存在几种细胞？对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选,就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体用特定的选择培养基进行筛选:在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长。用特定的抗原对小鼠进行多次免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。多种B淋巴细胞多种杂交细胞能分泌抗体的杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞抗体阳性检测体外条件下大规模培养杂交瘤细胞筛选单克隆抗体骨髓瘤细胞电融合、PEG融合、灭活病毒融合等特点：能大量增殖，并能产生特异性抗体未融合细胞同种融合细胞检测：以确认是否存在所需B淋巴细胞①体外培养需要防止发生接触抑制而影响产量吗？为什么？②为什么选B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？③杂交瘤细胞有何优点？（重点）[思考]不需要，具有瘤（癌）细胞的特性，没有接触抑制现象B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性──。在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体④单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的和方法分别是什么？[思考]第一次是用选择培养基筛选出杂交瘤细胞（多种）（未融合的细胞和同种融合细胞死亡）；第二次筛选是多次用克隆化培养和抗体阳性检测筛选出分泌特定单一抗体的杂交瘤细胞。针对一种抗原，并不是完全一致的一种抗体但是，这种培养，每孔都来源于一个杂交瘤细胞，单独扩增得到的就是一种抗体资料：①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基蝶呤阻断。②免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它本身不能分裂增殖，其本身也不能在体外长期存活。③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径被阻断的话，它会因不能合成DNA而死亡。请根据上述资料提出筛选出杂交瘤细胞的方法？培养基中加入氨基蝶呤B淋巴细胞骨髓瘤细胞（A）合成DNAD途径S途径D途径氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3⑤为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选？[思考]从小鼠体内获取的淋巴细胞，只有一部分分泌我们期望的抗体

（如可能有的是受其他抗原刺激而分化的，还有未分化分泌抗体的）需要用专一抗体阳性检测筛选产生同一种抗体的淋巴细胞，通过克隆化而形成产生单一抗体的细胞群，用于生产阳性孔融合后的细胞经特定的选择培养基筛选培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用96孔板培养，使每一个孔中细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为能产生特定抗体的杂交瘤细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。[视野拓展]杂交瘤的细胞的筛选原理方法第一次筛选的原理与方法：

细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：

一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。

另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的淋巴B细胞和两个淋巴B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。

由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。而杂交瘤细胞，既具有淋巴B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。[视野拓展]杂交瘤的细胞的筛选原理方法第二次筛选的原理和方法：

通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。

分别提出杂交瘤细胞产生的抗体,看能否和抗原形成杂交带⑥如果在体外克隆淋巴细胞后再用抗原刺激不是不需要筛选，操作更简单吗？[思考]不可以，抗原刺激淋巴细胞产生抗体还需要免疫系统的其他组成成分参与，比如吞噬细胞、T细胞、淋巴因子等⑦杂交瘤细胞一定会分泌单抗体吗？⑧我们能不能将浆细胞诱变癌变直接生产单克隆抗体？⑨利用小鼠获得的单克隆抗体，能直接用于人体吗？为什么？不一定，融合后可能影响原来的基因表达不能，癌变具有不定向性，而且正常遗传物质发生改变，一般不再表达抗体基因不能，单克隆抗体会被人体当做抗原，发生免疫反应。还需要其他技术进行人源化改造（将抗体除了识别抗原的区域之外的区域替换成人抗体的成分）4.单克隆抗体及其应用(5)单克隆抗体的应用①用作诊断试剂（最广泛的应用）应用原理：抗原与抗体的特异性结合（抗原-抗体杂交）应用优点：准确、高效、简易、快速;杂交瘤细胞可以培养、保存利

用；可以标准化生产应用实例：各类单抗诊断盒,定位诊断肿瘤、心血管畸形等P50①化学性质单一、纯度高；②能准确识别抗原细微差异，与特定抗原发生特异性结合；

（或答“特异性强、反应灵敏度高”）③可大量制备

血型检测试剂抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体比原来诊断方法提前了10d左右，准确率在90﹪以上。作用：识别，发挥靶向运输作用作用：杀伤治疗优点：①能在原位杀死癌细胞，还不损伤正常细胞②用药少，毒副作用小（或简答“特异性强；毒副作用小”）2.除了细胞毒素外，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原发生反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。4.单克隆抗体及其应用(5)单克隆抗体的应用应用原理：药物无特异性，与抗体构成“抗体-药物偶联物”（俗称“生物导弹”），实现选择性杀伤肿瘤应用优点：原位杀伤病变细胞而不损伤正常细胞，特异性强；用量少，疗效高、毒副作用小①用作诊断试剂（最广泛的应用）应用原理：抗原与抗体的特异性结合（抗原-抗体杂交）应用优点：准确、高效、简易、快速;杂交瘤细胞可以培养、保存利

用；可以标准化生产应用实例：各类单抗诊断盒,定位诊断肿瘤、心血管畸形等②用于治疗疾病和运载药物[思维拓展]①“单”——由单一B而来（同时，抗体化学性质也单一）

“克隆”——由B淋巴细胞，克隆而来的细胞群产生②因为对分散的细胞物体操作，融合是随机的、非特异性的、非100%的，所以存在多种类型细胞，需要筛选杂交瘤细胞。③两次筛选是有区别的，第一次是用选择培养基筛选出杂交瘤细胞（多种）；第二次筛选是多次用用克隆化培养和抗体检测筛选出分泌所需单一抗体的杂交瘤细胞。

第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞能生长用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体阳性检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞[思维拓展]④杂交瘤细胞具有无限增殖能力选择培养时得以保存；B淋巴细胞和同种融合的B淋巴细胞（浆细胞）不能增殖，死亡淘汰；瘤细胞和同种融合的瘤细胞可以通过特定化学物质阻断增殖而死亡淘汰（信息题）⑤杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体⑥我们通常理解为免疫后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，但实际上是受抗原刺激而开始分化的B淋巴细胞，此类细胞相当于介于未受刺激的B淋巴细胞和浆细胞之间的过渡类型的未成熟的但被激活的B淋巴细胞。（因为浆细胞难以融合并且融合后抗体表达会发生改变，难以达到目的）[视野拓展]

腹水怎么来的多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。单克隆恶性浆细胞(即骨髓瘤细胞)的大量增殖,侵犯骨髓与骨质，产生溶骨性改变；并影响骨髓的造血功能，导致贫血与出血。同时还产生大量单克隆免疫球蛋白，影响正常免疫球蛋白的生成，增加患者对细菌与病毒的易感性，由于免疫球蛋白或其多肽链亚单位（轻链）由尿中排出，常导致肾功能损害。

由于血浆中蛋白质含量的降低，引起水分大量进入到组织液中形成了腹水．[视野拓展]杂交瘤的克隆化和冻存

克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体特异性抗体分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。

克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。1.

如图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程。下列叙述错误的是()

A.反复给小鼠注射甲的目的是让小鼠体内产生更多的抗体B.人工诱导细胞融合获得乙的常用方法是用灭活病毒诱导法C.丁细胞既能无限增殖又能产生抗甲抗原的抗体D.制备的单克隆抗体可以早期诊断人体胃癌的发生情况A2.抗体导向酶——前药疗法是近几年发展起来的一种极有前景的靶向治疗技术，该方法能特异性杀死癌细胞。已知丝裂霉素是一种抗肿瘤药，丝裂霉素(MMC)前药几乎无毒性，经碱性磷酸酶(AP)催化后，活化的MMC对细胞有毒性。该技术的核心步骤是将单克隆抗体与AP交联成抗体导向酶后注入癌症患者体内。下列叙述正确的是()

A.应将MMC前药和抗体导向酶充分混合后，再注射到患者体内B.前药在人体内被激活，活化的MMC对细胞有毒性，产生较强的药物副作用C.该技术能提高化疗药物在肿瘤部位的靶向聚集，但无法减少化疗副作用D.可利用特定的前药分别与不同的单克隆抗体连接，制备一系列靶向性各异的单抗药物D[拓展训练]一个抗原往往有多个不同的抗原决定簇，一个抗原决定簇只能刺激机体产生一种抗体，由同一抗原刺激产生的不同抗体统称为多抗。将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗。下列说法正确的是（

）

A.注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响大

B.单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合

C.利用该小鼠只能制备出一种抗p72的单抗

D.p72部分结构改变后会出现原单抗失效而多抗仍有效的情况D

《西游记》中的孙悟空神通广大，他“拔一把毫毛丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声‘变’!即变作三二百个小猴”。孙悟空这样神奇的本领曾令我们无限神往。问题五？5动物体细胞核移植技术和克隆动物5.动物体细胞核移植技术和克隆动物(1)核移植概念将动物的一个细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重组的细胞发育成为一个新胚胎，继而发育成动物个体的技术（这种动物叫克隆动物）(2)核移植原理动物细胞核的全能性（膜的流动性、细胞增殖）属于无性繁殖技术胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，全能性容易表现细胞分化程度高，全能性难以表现①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其

前的功能状态，这导致了胚胎发育率低；②对非人灵长类动物

进行操作的技术尚不完善。胚胎分化5.动物体细胞核移植技术和克隆动物(3)哺乳动物核移植分类非人灵长类动物体细胞核移植的困难5.动物体细胞核移植技术和克隆动物(4)核移植过程从屠宰场l收集牛卵巢。采集卵母细胞；在体外培养至到MII期取体细胞；培养理论上注入核实际注入整个细胞细胞质基因少、影响小易操作、伤害小显微操作去核MII期通过电融合法使两细胞融合,供体核进入卵母细胞.形成重构胚将重构胚移植入受体（代孕）母牛生产物理或化学方法（电刺激、Ca2+载体、乙醇和蛋白酶抑制剂等）激活重构胚，完成分裂、发育克隆动物性别如何？[思维拓展]①选MII期（减二中期）卵母细胞作核移植的受体细胞的原因：

a.

MII期含有特定的细胞质成分

激发细胞核全能性的表达（含重组因子）；b.卵母细胞体积比较大，容易操作；c.卵母细胞的细胞质多，营养丰富，能为早期胚胎的形成提供营养.②去核问题：a.去核原因：为使核移植动物的核遗传物质全部来自有利用价值的动物b.实质：去掉MII期卵母细胞内“纺锤体—染色体复合物”；c.方法是显微操作去核法；（P54“相关信息”）

d.由于MII（减II）中期的次级卵母细胞还含有第一极体，所以去核时连第一极体一起除去另外，梯度离心，紫外光短时间照射，化学物质处理等。这些方法是在没有刺破透明带或卵母细胞质膜的情况下，去除细胞核或使卵细胞核DNA变性[思维拓展]③核移植：实际操作中，往往将整个供体细胞移植到去核的受体细胞中，刺激融合而得到杂种细胞。

原因：①细胞质中极少的遗传物质影响不大；②还可以减少机械操作对核物质的损伤；③易操作。④移植后通过电融合法使供体与受体细胞融合，供体核进入卵母细胞形成重构胚（此过程相当于受精过程——透明带内两个细胞融合）；⑤再用物理或化学方法（电刺激、钙离子载体、乙醇、蛋白质合成抑制剂等）激活重构胚完成减数分裂和发育进程。⑥动物体细胞核移植技术(克隆)从生殖方式的角度看属无性生殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。⑦动物细胞随分化程度增加，全能性受限制，但细胞核仍具有全能性（是指的一般体细胞）。比较原始的动物细胞也可以具有细胞全能性，如卵细胞、受精卵到囊胚前的细胞。①用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？

②为什么要对卵母细胞进行去核处理？③细胞核移植生产的克隆动物是对