动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节动物细胞工程第2章二动物细胞融合技术与单克隆抗体本节聚焦P48-501、什么是动物细胞融合技术？概念、结果、方法、原理、意义、应用2、单克隆抗体是如何制备的（图2-16）？过程、两次筛选目的和方法3、单克隆抗体在临床上有哪些应用？融合细胞细胞融合37℃40min正在融合的细胞红色荧光染料标记膜蛋白绿色荧光染料标记膜蛋白人细胞小鼠细胞回顾-必修一：细胞膜的结构1970年，细胞融合实验1.概念：使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.结果：形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。3.原理：细胞膜具有一定的流动性4.诱导融合的常用方法：PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法。与植物原生质体融合的基本原理相同动物细胞融合特有的诱导融合方法5.动物细胞融合的过程：细胞膜融合一、动物细胞融合技术细胞核融合细胞质融合细胞融合的实质6.动物细胞融合完成的标志：两个或多个细胞核融合为一个细胞核PEG融合法PEG可以使原生质体的膜位降低，然后，原生质通过钙离子交联促进凝聚。另外，由于PEG的脱水作用，扰乱了分散在原生质膜表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质颗粒的流动性，从而促进原生质体融合。融合方法扩展电融合法，是指利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿促进细胞融合的技术，是最常采用的物理诱导细胞融合的方法电融合法P48相关信息：灭活病毒诱导法灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。动物细胞A动物细胞B杂交细胞AB诱导、融合、筛选膜融合质融合核融合杂种细胞经第一次有丝分裂两个核才融合。细胞融合完成的标志:细胞核融合成一个核扩展:动物细胞融合过程思考：诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？为什么？不一定，诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。P49思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。肺结核病人病理切片5.优点突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。一、动物细胞融合技术6.应用①研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。②利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。1.传统抗体的生产方法缺点：制备的抗体一般为多克隆抗体，产量低、纯度低，特异性差向动物反复注射某种抗原使动物产生抗体从动物血清中分离所需抗体二、单克隆抗体技术及其应用抗原免疫过程传统抗体多种混合①怎样才能得到纯的抗体？每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，想要获得单一的纯抗体，就必须从一个B细胞出发。②光纯还不行，还要大量，怎么办？让B细胞大量繁殖（克隆）就可以产生大量抗体了。③但，有问题：找，什么细胞能无限增殖呢？B细胞是不能无限增殖的，怎么办？癌细胞。但它不能产生抗体。二、单克隆抗体技术及其应用2.单克隆抗体的制备1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：解决：米尔斯坦【英国】科勒【德国】二、单克隆抗体技术及其应用一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞动物细胞融合杂交瘤细胞动物细胞培养大量的特定抗体注射到腹腔注射抗原培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合多种杂交细胞诱导融合抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长多轮次的克隆化培养和抗体检测体外大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体杂交瘤细胞单克隆抗体注射抗原多种B淋巴细胞用特定抗原对小鼠免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞思考1：为什么用特定抗原对小鼠免疫，小鼠体内会产生多种B淋巴细胞？一种抗原可能含有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇刺激机体产生一种特定的B淋巴细胞进行诱导融合后，培养基中会有哪些种类细胞？思考2:如何筛选(第一次筛选)出所需的杂交瘤细胞？思考3:未融合的亲本细胞、融合的具有同种核的细胞、杂交瘤细胞。特定的选择培养基资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径。B淋巴细胞骨髓瘤细胞（A）合成DNAD途径S途径D途径氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3拓展：如何筛选杂交瘤细胞（第一次筛选）思考4:如何从多种杂交瘤细胞中筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞？（第二次筛选）用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。拓展：克隆化培养、抗体检测？①将杂交瘤细胞进行有限稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。②然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。③阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。检测原理？抗原—抗体特异性结合思考5:如何大量培养杂交瘤细胞，获得单克隆抗体？将抗体检测阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖，从而获得大量单克隆抗体。【培养杂交瘤细胞的方法比较】项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高从已免疫小鼠的脾脏中取B淋巴细胞小鼠腹腔多种杂交细胞抗体检测阳性的杂交瘤细胞细胞融合选择培养

第一次筛选骨髓瘤细胞杂交瘤细胞单克隆抗体体外细胞培养克隆化培养与抗体检测

第二次筛选整理：单克隆抗体制备的过程思考7:单克隆抗体的制备利用了动物细胞工程的哪些技术？动物细胞融合动物细胞培养项目第一次筛选第二次筛选（需要多次筛选）筛选原因方法筛选结果诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合细胞等用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。筛选出融合的杂种细胞选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞二、单克隆抗体技术及其应用诊断试剂运载药物治疗疾病P50应用二、单克隆抗体技术及其应用思考讨论资料1

用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。二、单克隆抗体技术及其应用

在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。抗（人绒毛膜促性腺激素）单克隆抗体思考讨论资料2

使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drugconjugate,ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。二、单克隆抗体技术及其应用抗体药物接头细胞凋亡ADC被细胞吞噬P50:讨论1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？

抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞。药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。讨论2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？

可用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。二、单克隆抗体技术及其应用讨论3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床上各具有什么优势？

单克隆抗体诊断试剂盒中的抗体只与特定的抗原反应，故特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，利于控制产品的质量和标准化生产。

ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。二、单克隆抗体技术及其应用讨论4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？作为药物治疗疾病二、单克隆抗体技术及其应用本堂小结一、概念检测1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株P51练习与应用C总结：植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理诱导融合的方法意义和用途打破生殖隔离，实现远源杂交育种，培育植物新品种细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物细胞的全能性纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后诱导原生质体融合胰（胶原）蛋白酶使细胞分散后诱导细胞融合物理（电融合法、离心法）化学（聚乙二醇融合法、高Ca2+-高pH融合法）物理（电融合法）化学（聚乙二醇（PEG）融合法）生物方法：灭活的病毒诱导法获得杂种细胞、制备单克隆抗体两者都用到细胞融合和细胞培养技术；融合中都会发生多种融合方式，因此都要进行筛选。共同特点：2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体练习与应用A练习与应用二、拓展应用假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。单克隆抗体制备过程中的相关考点总结（1）该过程中应用到的技术_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）诱导融合的方法______________________________________动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法（5）第一次筛选的目的______________________

第一次如何筛选___________________________

筛选原理_________________________________________________________________________________筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________（7）第二次筛选的目的_____