木霉TP100726菌株固体发酵及所产纤维素酶酶学性质的研究

木霉TP100726菌株固体发酵及所产纤维素酶酶学性质的研究摘要本试验以在木霉TP100726菌株固体发酵基质中加入木糖渣为目的，研究其在其它条件不变的情况下木糖渣对原始配方中稻草的替换，并进一步考察木霉TP100726菌株所产纤维素酶的酶学性质及糖化木糖渣的情况。结果表明，木糖渣可替代20%的稻草粉。纤维素酶的最适温度为50℃，最适pH为5.0，在50℃，pH=5.0时较稳定。以木糖渣为底物，柠檬酸缓冲液，料液比为1:10，温度为50℃，pH5.0时，糖化木糖渣酶活最高，为833U/ml。为利用工业废弃物木糖渣作为原材料发酵生产可发酵糖提供了基础数据。关键字：固体发酵，纤维素酶，木糖渣，酶学性质AbstractTheexperimentsisinordertojointhexyloseresidueinthesolidfermentationsubstrateofTrichodermaTP100726strains,andstudythexyloseresidueinthecaseofotherconditionsremainunchangedonthereplacementoftheoriginalformulainthestraw,andfurtherinvestigatedtheTrichodermaTP100726straincellulaseproducedbytheenzymaticpropertiesandsaccharificationxyloseresidue.Theresultsshowthatxyloseresiduecanreplace20%ofthestrawpowder.Thecellulase'soptimaltemperatureis50°C,theoptimumpHis5.0,anditismorestableat50°C,pH=5.0.Xyloseresiduesubstrate,citratebuffersolution,solidtoliquidratioof1:10,temperature50°C,pH5.0andthehighestenzymeactivityisachieveto833u/ml.Itprovidesthebasicdataofusexyloseslagasrawmaterialstofermentationproductionoffermentablesugars.Keywords:solidfermentation,celluloseenzyme,xyloseslag,properties2木霉TP100726号菌株固体发酵培养基的优化2.1试验材料2.1.1试验菌种木霉TP100726号菌株，实验室培养。2.1.2发酵原料来源木糖渣：由河南濮阳研光鹏程生物制品有限公司提供。半纤维素23.5%、纤维素21.3%、木质素6.70%、其它48.50%[12~14]。麸皮：市场购置，粉碎至40~60目，备用。稻草粉：市场购买南阳豆粉：市场购买2.1.3试验试剂及配制（1）试验试剂试验所用试剂见表2.1表2.1试验所用试剂试剂纯度生产厂家磷酸氢二钾A.R吴江市天源化工有限公司氢氧化钠A.R郑州派尼化学试剂厂生物传感仪标准液B.R山东省科学院生物研究所3,5-二硝基水杨酸A.R国药集团化学试剂有限公司酒石酸钾钠A.R天津市凯通化学试剂有限公司无水亚硫酸钠A.R天津市永大化学试剂开发中心苯酚A.R天津市风船化学试剂科技有限公司硫酸铵A.R北京奥博星生物科技有限公司（2）试验试剂配制[15~18]DNS溶液（3，5-二硝基水杨酸）：称取3,5-二硝基水杨酸5g，置于300ml水中，逐渐加入NaOH5g,于45℃水浴中搅拌溶解，再加入酒石酸钾钠100g，苯酚0.5g，无水亚硫酸钠2.5g，定容至500ml0.05M柠檬酸缓冲液：A液：称7.56504g柠檬酸，溶于720ml去离子水中。B液：称17.646g柠檬酸钠，溶于1200ml去离子水中。A液和B液慢慢混合，制成pH=5的缓冲液。CMC试剂的配制：称取1g羧甲基纤维素钠于100ml柠檬酸缓冲液中，待溶解后置于冰箱中保存。1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取经80℃~100℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，充分混匀后，于2.1.4试验仪器试验所用仪器如表2.2所示：表2.2试验所用仪器名称型号生产厂家生物传感分析仪SBA-40c山东省科学院生物研究所电热恒温培养箱DH4000B型天津市泰斯特仪器有限公司UV-VIS分光光度计UV1700SHIMADZUCORPORATION灭菌锅YXQ-LS-30SII上海博讯实业有限公司电子天平(普通)YP601N上海精密科学仪器有限公司冷藏陈列柜LSC-269CW星星集团有限公司纯水仪Synergy®UV美国Millipore公司冰箱BCD-207AK合肥美菱股份有限公司烘箱DV-600YAMATOSCIENTIFICCO，LTD.电热恒温水浴锅HSQ-3上海智诚分析仪器制造有限公司pH仪RHS-3C上海鹏顺科学仪器有限公司恒温振荡摇床智诚ZHWY-103D上海智诚分析仪器制造有限公司离心机TGL－16B上海安亭科技仪器厂-80°C低温冰箱MDF-U4086S日本SANYO2.1.5培养基活化培养基：PDA培养基：取200g去皮洗净的土豆切成小块，加水煮烂后滤出上清后定容至1000ml，加入2%葡萄糖，2%琼脂，107℃灭菌20min基础发酵培养基：60%麸皮，40%稻草粉，3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4固液配比:1:1.5，装料比:每250ml锥形瓶加6.0g固体成分。121℃高压蒸汽灭菌25min2.1.6粗酶液的制备当菌株培养一定天数后，用柠檬酸缓冲液按1:10的固液比浸提3小时，然后4000r/min离心10min，取上清即为粗酶液。2.2试验方法2.2.1木霉TP100726菌株固体发酵配制培养基原始固体配比:60%麸皮，40%稻草粉，无机盐溶液:3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4发酵培养基：固体基质按正交表（表2.3）中组合进行配制，不足6.0g的用稻草来补。无机离子组成：3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4固液配比:1:1.5，装料比:每250ml锥形瓶加6.0g固体成分（1）设计正交表表2.3正交实验各因素与水平因素麸皮木糖渣豆粉11（20%）1（10%）1（0%）22（40%）2（20%）2（1%）33（60%）3（30%）3（2%）（2）在超净工作台里，将培养基放入，紫外灭菌15min，然后无菌操作接入一环孢子，放于28℃（3）在培养过程中，从第五天开始，每隔24h取发酵基质一瓶，加入60ml缓冲液（固体装料质量：缓冲液体积=1:10），浸提3-5h（4）取浸提液于离心管中，4000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。（5）根据2.2.4中酶活测定方法测定粗酶液的FPA酶活和CMC酶活。2.2.2观察表面观察用PDA培养基活化保存的菌株，并在培养过程中观察木霉TP100726菌株菌落形态随时间变化的情况。霉菌形态观察用乳酸石碳酸棉兰染色液对木霉TP100726菌株进行染色并观察，首先于洁净载玻片上滴一滴乳酸碳酸棉兰染色液，再用解剖针从霉菌菌落的边缘取少量带有孢子的菌丝置于染色液中。细心地将菌丝挑散开，小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。最后置显微镜下进行观察。2.2.3制作葡萄糖标准曲线取5支试管，按表2.4加入1000μg/ml标准葡萄糖液及去离子水，得到从100μg/mL~800μg/ml的标准管。分别吸取上述不同浓度的葡萄糖溶液1ml，DNS试剂1ml，混合均匀，沸水浴加热7min，取出，用水冷却，用去离子水定容至10ml，置分光光度计上540nm处测定光密度值，以空白管(0管)做对照。表2.4标准葡萄糖液配比管号1000μg/ml葡萄糖（ml）H2O（ml）葡萄糖浓度C（g/L）001001190.12280.23460.44640.65820.82.2.4酶活测定方法[19~21]FPA测定：取0.5ml适当稀释的粗酶液，加入pH5.0的0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液0.5ml，混匀后加入1×6cm新华滤纸条，空白对照中加入1mlDNS，于50℃保温1h（先预热5min），然后加入1mlDNS沸水浴7min，流水冷却至室温，用蒸馏水定容至10ml，在540nm处测定ODCMC酶活测定：取0.5ml适当稀释粗酶液，加入0.5ml由pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制而成的1%CMC-缓冲液，空白对照中加入1mlDNS，50℃保温30min（先预热5min），然后加入1mlDNS沸水浴7min，流水冷却至室温，定容至10ml，540nm处测定OD实验中酶活力定义（IU）：每克培养基中木霉TP100726号菌株每分钟产生的葡萄糖的微摩尔数。即每毫升粗酶液每分钟产生葡萄糖的微摩尔数乘以缓冲液浸提比。2.3实验结果2.3.1观察结果菌株长势观察菌落（如图2.1）初为白色，致密，圆形，向四周扩展，后从菌落中央产生绿色孢子，中央变成绿色。菌落周围有白色菌丝的生长带。分生孢子（如图2.2）呈绿色，为椭圆球状，菌丝呈不规则分枝形状。表2.5为木霉TP100726菌株随时间变化的生长情况：表2.5木霉TP100726菌株生长情况培养时间生长情况24h局部有极少量白色菌丝，大部分培养基裸露48h白色菌丝量增加，形成块状，但菌丝量仍较少，无孢子72h白色菌丝布满培养基表面，呈棉絮状，其上长有一层绿色孢子96h培养及表面布满绿色孢子，只可见少量白色菌丝96h以后培养基中满是绿色孢子，无菌丝图2.1木霉TP100726菌株生长情况图2.2菌丝及孢子形态2.3.2葡萄糖标准曲线制作以葡萄糖浓度（g/L）为横坐标，OD值为纵坐标制作葡萄糖标准曲线，如图2.3所示：图2.3葡萄糖标准曲线（公式1）x为OD值，y为葡萄糖含量，单位为g/L。2.3.3酶活计算公式（公式2）y为葡萄糖含量的数值（由标准曲线和所测OD值计算可得），N为粗酶液稀释倍数，n为微摩尔数与摩尔数之间换算关系，为106，10为缓冲液所用体积与固体质量之间比值，180.0为葡萄糖的摩尔质量，60为反应时间60min，1000为y的单位从g/L换算成g/ml。由以上可得OD值和酶活的直接计算公式(公式3）2.3.4正交实验结果本次正交实验目的是确定培养基中麸皮、木糖渣、豆粉和稻草粉这几种物质的最优配比，以得出木糖渣代替稻草粉的最大量。表2.6和表2.7分别为本实验测定的滤纸酶活和CMC酶活。表2.6滤纸酶活编号麸皮木糖渣豆粉结果11（20%）1（10%）1（0%）38.264212（20%）2（1%）38.551313（30%）3（2%）31.60342（40%）1240.848522343.545623137.23073（60%）1341.939832142.398933241.652K136.13940.35039.297K240.54141.49840.350K341.99636.82839.029R5.8574.6701.32110（原始配方）60%0044.350表2.7CMC酶活编号麸皮木糖渣豆粉结果11（20%）1（10%）1（0%）39.355212（20%）2（1%）41.996313（30%）3（2%）38.09242（40%）1238.379522341.250623137.28873（60%）1339.125832141.422933240.618K139.81438.95339.355K238.97241.55640.331K340.38838.66639.489R1.4162.8900.97610（原始配方）60%0041.996从以上两表中可以看出，麸皮、木糖渣、豆粉三因素对纤维素酶活的影响因素大小顺序为：滤纸酶活中，麸皮>木糖渣>豆粉，CMC酶活中，木糖渣>麸皮>豆粉。由此可见，豆粉对纤维素酶活的影响较小。从均值来看，两种酶活中均表现出培养基固体物质最优配比为麸皮60%，木糖渣20%，豆粉1%。可以初步认为木糖渣可以代替20%的稻草粉。但原配方中没有这种组合，为了能更准确的确定最佳配比，仍需再次做一组培养实验来进行对比。但由于各种原因，本实验来不及做重复实验了，这些数据只有留待下届学生继续完成。3纤维素酶酶学性质的研究3.1实验材料3.1.1实验原料木霉TP100726菌株所产纤维素酶粗酶液，由所有发酵料混合浸取所得。3.1.2实验试剂及仪器见表2.1及表缓冲液配制不同pH的柠檬酸缓冲液，配制方法如表3.1。表3.1不同pH的柠檬酸缓冲液pH0.05M柠檬酸(ml)0.05M柠檬酸三钠(ml)4.560605.040805.526946.0131073.2实验方法3.2.1测定方法FPA及CMC酶活测定方法见2.2.3.葡萄糖测定方法：水解液中葡萄糖的测定采用由山东科学院生物研究所研发的SBA-40E生物传感分析仪进行测定。测定方法如下：准确吸取稀释适当的样品25μL注入到已经定好标的生物传感分析仪中，数据结果换算成样品中葡萄糖再乘以稀释倍数，计算出水解液中葡萄糖。木糖渣酶活：木糖渣为底物的酶活定义：每克培养基中木霉TP100726菌株每小时产生的葡萄糖的微摩尔数。即每毫升酶液每小时产生葡萄糖的微摩尔数乘以浸提比。计算方法：（公式4）T为SBA-40E生物传感分析仪制定的数值N为稀释倍数。纤维素转化率：定义为糖化木糖渣中所产生的葡萄糖的质量占所加木质纤维素的量的百分率。计算方法：纤维素转化率=葡萄糖质量*100/木质素质量（公式5）3.2.2粗酶液稀释倍数的确定将粗酶液稀释至50倍、100倍、200倍、400倍，按照2.2.3中的方法测定FPA及CMC酶活。3.2.3酶学性质研究（1）酶液最适温度将合适稀释倍数的酶液分别在45°C、50°C、55°C、60°C下测定酶液的FPA和CMC酶活。（2）酶的热稳定性取40ml稀释后的酶液，分装于5个试管中，分别置于45°C、50°C、55°C、60°C恒温水浴锅中进行保温3h，从各个试管中取出0.5ml酶液，测定在各个温度下保温过的酶的FPA和CMC酶活。以酶活最高的那个温度下所得到的测定值为参照，其他温度下测得的酶活力与最高值相比。（3）酶最适pH值在室温条件下，配置不同pH值的缓冲液，pH值设定为4.5、5.0、5.5、6.0，在最适的反应温度下，测定不同pH值对酶活力的影响。（4）酶的pH值稳定性将粗酶液放入不同pH值的缓冲液中，混匀后封口于50°C下恒温水浴3h，测定在不同pH条件下剩余的酶活，以酶活最高的那个pH值条件下所得到的测定值为参照，其他pH值条件下测得的酶活力与最高值相比。3.2.4粗酶液糖化木糖渣条件初步研究（1）木糖渣糖化的最适pH柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L，料液比1:10，酶解温度50°C，摇床转速180r/min。考察水解pH对酶解的影响。pH分别设置为4.5、5.0、5.5、6.0。酶解48h后取样测定水解液中葡萄糖浓度。（2）木糖渣糖化的最适温度在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度为0.05mol/L，料液比1:10，水解pH5.0，摇床转速180r/min下，考察温度对酶解的影响。温度分别设置为45°C、50°C、55°C、60°C。酶解48h后取样测定水解液中葡萄糖浓度。（3）料液比对酶解的影响为考察不同料液比（1:20、1:15、1:10、1:8）对木糖渣糖化的影响，在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L，酶解温度50°C，pH5.0摇床转速180r/min下，48h后测定水解液中葡萄糖浓度，计算木糖渣中纤维素转化率。（4）粗酶液糖化不同木质纤维素柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L，料液比1:10，水解pH为5.0，酶解温度50°C，摇床转速180r/min，选用木糖渣，玉米芯，稻草粉，酶解48h后测定水解液中葡萄糖浓度。（5）糖化木糖渣最适缓冲液选择配制0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，磷酸缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，按照木糖渣与混合液比例为1:10与50°C，180r/min下酶解48h，测定水解液中葡萄糖浓度。3.3结果与分析3.3.1酶液稀释倍数的确定粗酶液进行反应时，如果酶液浓度过高，就会使大部分酶分子不能接触到底物，从而影响酶活的准确度；如果酶液浓度过低，则会使酶分子不能与底物良好接触，同样会影响酶活的准确度。因此，需要在实验前确定好酶液的稀释倍数，使其能最好的与底物进行反应，尽量减小实验误差。图3.1粗酶液稀释倍数实验数据根据图3.1所示及所测吸光度值的大小分析可得，滤纸酶活在酶液稀释50倍~100倍区间稀释倍数最佳，CMC酶活在酶液稀释100倍~200倍区间稀释倍数最佳。3.3.2酶学性质研究（1）纤维素酶最适温度温度是影响酶活性及酶稳定性的一个重要参数。一般说来，酶在一定的温度范围内，催化反应的速率和温度成正比，温度越高，反应速率越快。但在超出一定范围后，高温可使酶蛋白失活，酶的反应速率就会迅速下降。如图3.2所示，木霉TP100726号菌株所产粗酶液在45~50°C时，其CMC酶活与FPA均随温度的升高而增加，50~60°C时，其CMC酶活与FPA则下降。故纤维素酶的最适温度为50℃，其滤纸酶活为48IU，CMC酶活为63IU图3.2粗酶液最适反应温度（2）纤维素酶最适pH纤维素酶活力与pH值密切相关，影响酶活的原理可能有以下几个方面：过酸、过碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活；同时pH还会影响底物分子与酶分子的中间产物解离状态，这些中间产物的离子化状态与酶的专一性及酶分子的活力中心的构象有关。一般情况下，木霉属所产纤维素酶多为酸性纤维素酶，如图3.3所示，纤维素酶受pH的影响较大，pH在4.5~5.0时，纤维素酶活性逐渐升高，而在5.0~6.0时纤维素酶活性则下降较快，可见该纤维素酶并不能在中碱性条件下发挥作用。所以木霉TP100726菌株所产纤维素酶的酶促反应最适pH为5.0，其滤纸酶活为25IU，CMC酶活为106IU。图3.3粗酶液最适反应pH（3）纤维素酶的热稳定性纤维素酶在一定的温度下可达到较高酶活，但是在该温度下并不一定是稳定的，长时间保温下容易变性失活，因此在不同温度下考察其剩余酶活力情况，对纤维素酶的保存及纤维素酶用于长期水解木质纤维素都有重要的意义。如图3.4所示，在45~50°C保温3h后其酶活力损失较少，而在50~60°C时，纤维素酶酶活力则迅速下降，此时可以看到大量的酶蛋白沉淀。所以纤维素酶可在50℃图3.4纤维素酶粗酶液热稳定性（4）纤维素酶的酸碱稳定性在一定温度下，pH值对酶稳定性会产生很大的影响，通过研究不同pH值条件下酶的酸碱稳定性以期找出最大限度发挥酶的催化活性的pH值。从图3.5中可知，木霉TP100726菌株所产纤维素酶酶50°C时，pH在5.0左右时较为稳定，pH低于5.0或高于5.5均导致纤维素酶活力下降。图3.5纤维素酶粗酶液酸碱稳定性3.3.3粗酶液糖化木糖渣研究（1）糖化木糖渣的最适pH酶解中的pH对木糖渣的糖化效果的影响从图3.6可以看出，粗酶液糖化木糖渣的效果受糖化过程中pH变化的影响较小。pH在4.5提高至5.0时，葡萄糖量由3.2%（%为1ml粗酶液中葡萄糖所占的百分量）提高至3.3%。将pH提高至5.0后，葡萄糖量迅速下降，由3.3%降至3.0%。由此可知pH在5.0时效果最佳。图3.6糖化木糖渣最适酶解pH（2）糖化木糖渣的最适温度最适的酶解温度有利于提高酶解效果，提高水解液中葡萄糖的含量，温度过高或过低都会影响酶解反应的效果。木霉多产粗酶液酶解纤维素的最适温度多在45~50°C之间。由图3.7可知木霉TP100726菌株所产粗酶液在50°C左右均能够很好的糖化木糖渣，但以50°C时最佳，此时葡萄糖浓度为3.4%。图3.7糖化木糖渣最适温度选择（3）料液比对木糖渣糖化的影响料液比对酶解的影响结果从图3.8可以看出，随着料液比的提高，葡萄糖量逐渐增加，纤维素转化率逐渐降低。料液比从1:20增加到1:10时，葡萄糖量明显提高，从1:10增加至1:8时，葡萄糖量增幅并不明显，纤维素转化率明显下降。酶解液中糖浓度过低不利于发酵实验，故选1:10作为最佳料液比，此时葡萄糖含量为3.6%。图3.8不同料液比对糖化木糖渣的影响（4）粗酶液糖化不同木质纤维素情况以木糖渣、玉米芯、稻草为水解对象，考察木霉TP100726菌株所产粗酶液对不同的木质纤维素水解情况。由图3.9可知，在酶解48h后，酶解木糖渣所得葡萄糖量为3.8%。酶解稻草粉所得葡萄糖量为3.1%，玉米芯为3.0%。由此可见，糖化木糖渣水解的最佳底物为木糖渣。图3.9不同种类木质纤维素水解情况（5）缓冲液体系选择pH缓冲系统对维持生物的正常pH值、正常生理环境起重要作用。不同的缓冲体系使所产酶产生不同的酶解效果。由图3.10可知，三种缓冲体系对糖化木糖渣影响中以柠檬酸-柠檬酸钠为宜，此时葡萄糖含量为3.8%。图3.10不同缓冲液体系对糖化木糖渣的影响4结论与讨论木霉TP100726菌株原始配方中没有木糖渣，本实验将木糖渣添加进去，考察了木糖渣对稻草粉替代的可能，并对改良后发酵的纤维素酶粗酶液水解木糖渣进行探所，结果如下：1、木霉TP100726菌株固体培养基中固体物质配比为麸皮60%，木糖渣20%，豆粉1%，稻草粉20%。木糖渣可替代原始配方中稻草粉含量的20%左右。2、木霉TP100726菌株所产纤维素酶的最适反应温度为50℃，最适pH为5.0，在50℃，3、以木糖渣为底物，柠檬酸缓冲液，料液比为1:10，温度为50℃，pH5.0但是，由于时间的关系，本实验还有很多方面需要改进。培养基固体配比实验中只是优化了一步，还需做进一步的优化实验。如对本实验所得配比结果与其它几组酶活较高的实验组进行对比，进一步确定最优的配比方案。影响酶活性质的因素除了温度和pH外，还有很多其他因素对纤维素酶的酶活有较大影响。如：金属离子、酶解反应时间、底物浓度等，这些均需要做进一步的研究。参考文献[1]刘燕,张宏福,孙哲.纤维素酶的分子生物学与基因工程研究进展[J].饲料工业,2007,28(18):11--14.[2]高培基.纤维素酶降解机制及纤维素酶分子结构与功能研究进展[J].自然科学进展,2003,13(1):21--29.[3]顾方媛,陈朝银,石家骥等.纤维素酶的研究进展与发展趋势[J].微生物学杂志,2008,28(1):83--86.[4]SukumaranRK,SinghaniaRR,PandeyA.Microbialcullulasesproduction,applicationsandchallenges[J].Sci[5]WheelerMarshaM,ZhouXG,ScharfMichaelE,etal.MoLecularandbiochemicalmarkersformonitoringdynamicshiftsofcelluolyticprotozoainReticulitermesflavipes[J].InsectBiochemistryandMolecularBiology,2007,37(12):1366-1374.[6]陈小坚.纤维素酶的分子生物学研究及应用进展[J].湖北民族学院学报,2006,23(4):48--51.[7]庞宗文,董志刚,梁静等.高温放线菌6PL1纤维素酶的酶学性质研究[J].现代食品科技,2006,22(2):20~23.[8]Zhang,Y.H.P,Lynd,L.R.Afunctionallybasedmodelforhydrolysisofcullulosebyfungalcullulase[J].Biotechnol.Bioeng,2006,94(5):888–898.[9]吴翔,陈强,徐丽华.一株降解纤维素的高温放线菌的筛选及其产酶条件研究[J].农业环境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