2024-2025学年高二生物人教版选择性必修3 第1章 第2节 第2课时 微生物的选择培养和计数

第2课时微生物的选择培养和计数[学习目标]1.阐明微生物选择培养的原理。2.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。一、选择培养基、微生物的选择培养和数量测定1．选择培养基(1)自然界中目的菌的筛选①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的水生栖热菌中提取出来的。②依据：水生栖热菌能在70～80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。(2)实验室中目的菌的筛选①原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。②方法：利用选择培养基分离。选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。2．微生物的选择培养(1)方法：对样品进行充分稀释，然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。(2)稀释涂布平板法的操作过程①系列稀释操作a．编号为1×102～1×107试管中分别盛有9mL无菌水。b．将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。c．取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。②涂布平板操作取菌液：取0.1mL菌液，滴加到培养基表面↓涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中↓涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布↓涂布平板：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d。3．微生物的数量测定(1)稀释涂布平板法①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②计数原则：一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。③计算公式每克样品中的菌株数＝eq\f(某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,涂布平板时所用的稀释液的体积mL)×稀释倍数(2)显微镜直接计数法一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。特别提醒显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，因此一般用来统计总菌数。但是，通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。判断正误(1)以尿素为唯一氮源的培养基是选择培养基()(2)脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源()(3)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量()答案(1)√(2)×(3)×提示(2)分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨(NH3)，氨可作为细菌生长的氮源。(3)利用显微镜直接计数法统计的细菌数量无法区分死菌和活菌。任务一：微生物的选择培养和计数1．通常1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。设计一种以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以将分解尿素的细菌分离出来。2.用平板划线法接种培养结果的图片如图。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？提示不能；平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。3.当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养的结果如图所示。与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？提示稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原液中的活细菌数。4．请计算：4号试管的结果表明每克土壤中的活菌数约为1.1×108个。5．通过稀释涂布平板法统计的菌落的数目往往比活菌实际数目少。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。6．请完善表格中稀释涂布平板法和显微镜直接计数法的比较。项目稀释涂布平板法显微镜直接计数法主要用具培养基等显微镜、血细胞计数板或细菌计数板等计数依据培养基上的菌落数菌株本身优点计数的都是活菌计数方便、操作简单缺点操作复杂、有一定误差死菌、活菌都计数在内1．选择培养基的类型类型条件分离得到的菌种改变培养条件70～80℃的高温水生栖热菌添加某种化学物质加入青霉素酵母菌、霉菌等真菌高浓度食盐金黄色葡萄球菌特殊碳源、氮源石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物营养缺陷不加碳源自养型微生物不加氮源固氮菌2.两种纯化方法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法主要步骤接种环在固体培养基表面连续划线等比稀释操作和涂布平板操作接种工具接种环涂布器单菌落的获得从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落用途分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落；②用于计数菌落分布共同点都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征1．(2023·广东，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是()A．a点时取样、尿素氮源培养基B．b点时取样、角蛋白氮源培养基C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基D．c点时取样、角蛋白氮源培养基答案D解析研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确。2．如图是纯化微生物时采用的两种接种方法接种后培养的效果图，下列相关叙述正确的是()A．图甲三个平板中所用培养液的稀释倍数相同B．图甲、乙均适合分离微生物，但乙不适合对微生物进行计数C．图甲、图乙所用的接种工具分别是接种环和涂布器D．图乙每次划线应从同一起点开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落答案B解析根据图甲中三个平板的菌落密度可知，三个平板中所用培养液的稀释倍数不同，A错误；图甲、乙中若均为选择培养基，均可用于分离微生物，图乙是平板划线法接种后的结果，不适合对微生物进行计数，B正确；稀释涂布平板法接种工具为涂布器，平板划线法接种工具为接种环，C错误；图乙每次划线应从上一次划线的末端开始，以便使聚集的菌种逐步稀释获得单菌落，D错误。二、探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1．实验设计(1)土壤取样①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。②取样部位：距地表约3～8cm的土壤层。(2)样品的稀释测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验时可以将稀释的范围放宽一点。(3)微生物的培养与观察①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。②观察a．观察方法：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏部分菌落。b．记录菌落的特征：包括菌落的形状、大小和颜色等。2．操作提示(1)无菌操作：取土样的用具在使用前都需要灭菌。(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。判断正误(1)测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同()(2)利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数()(3)菌落特征是鉴别菌种的重要依据()答案(1)×(2)×(3)√提示(1)土壤中各种微生物的数量不同，因此分离不同的微生物要采用不同的稀释度。(2)当两个或多个菌落连在一起时，只能观察计为一个菌落，因此利用稀释涂布平板法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目少。任务二：土壤中分解尿素的细菌的分离、计数与鉴定1．测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？提示不相同；因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。2．甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果不可靠(填“可靠”或“不可靠”)。若不可靠，应如何改进？提示为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理不合理(填“合理”或“不合理”)。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。3．尝试完成下表中对微生物的分离与计数实验结果的分析。目的现象结论是否有杂菌污染的判断对照组的培养基中无菌落生长未被杂菌污染培养物中菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入其他杂菌选择培养基是否起筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基具有筛选作用4.利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？并说明理由。提示不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。5．细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解菌。依据以上原理，如何对分离得到的微生物是否是分解尿素的细菌作进一步鉴定？提示在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若菌落周围出现红色环带，则可说明该菌种能够分解尿素。选择培养基与鉴别培养基项目选择培养基鉴别培养基特殊成分加入某种化学物质加入某种指示剂或化学药品目的抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长与微生物的代谢物或培养基中的成分发生特定反应用途培养、分离出特定微生物鉴别不同的微生物举例培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并有金属光泽)3．(多选)下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述，正确的是()A．利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是有恰当的稀释度B．若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置未接种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照C．该实验应采用稀释涂布平板法D．用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌后会使酚红指示剂变红答案AC解析利用稀释涂布平板法估算菌落数目的关键是有恰当的稀释度，若稀释倍数太低、菌落数目太多，会连在一起，稀释倍数太高，平板上菌落数目过少，都不宜进行计数，A正确；若要判断选择培养基是否起到了选择作用，需设置接种在没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基上培养作为对照，B错误；分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解产生氨，使培养基的碱性增强，用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基来培养该细菌，能维持pH稳定，不会使酚红指示剂变红，D错误。4．(2023·连云港高二期末)在做“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”的实验时，甲同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。下列有关叙述错误的是()A．甲同学出现这种结果的原因可能是土样不同，也可能是操作过程出了问题B．将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养作为空白对照，可以证明培养基是否受到污染C．让其他同学用与甲同学一样的土壤进行实验，如果结果与甲同学一致，则可以证明甲同学无误D．B、C选项的实验思路都遵循了实验的对照原则答案D解析B选项的实验思路遵循了实验的对照原则，C选项的实验思路遵循了实验的重复原则，D错误。课时对点练[分值：100分]第1～9题，每题6分；第10～11题，每题7分，共68分。题组一选择培养基和微生物的选择培养1．(2022·江苏，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是()A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌答案D解析农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A合理；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，能合成脲酶的微生物在该培养基上能生长，B合理；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C合理；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D不合理。2．(2023·邢台高二期中)原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是()A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上D．在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种答案C解析若将土壤稀释液进行灭菌，则不能筛选出能高效降解原油的菌株，C错误。3．油烟污染由多种有害物质组成，不易降解。某同学从长期受到油烟污染的环境中分离出油烟降解菌，其筛选分离过程如图所示。下列叙述正确的是()A．图中①～③的过程为梯度稀释B．在培养基中加入油烟污染物，其作用是为微生物提供碳源和能源C．④使用的是固体培养基，需加入琼脂作为微生物生长繁殖的营养物质D．过程④可采用稀释涂布平板法或平板划线法分离菌种并进行计数答案B解析图中①～③的过程中加入油烟污染物作为唯一碳源，能够初步筛选出能分解油烟的微生物，故该过程称为选择培养，A错误；配制固体培养基时加入琼脂，其作用是作为凝固剂，而不是为微生物生长提供碳源，C错误；分离菌种常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，但对活菌进行计数时常用稀释涂布平板法而不能用平板划线法，D错误。4．(2024·石家庄高二期末)稀释涂布平板法是微生物培养与计数中常用的方法，下列叙述错误的是()A．由于土壤中细菌的数量庞大，需将土壤溶液稀释后再涂布在选择培养基上培养计数B．稀释涂布平板法操作时可用无菌水进行稀释C．涂布器使用前和使用后均需要灼烧灭菌D．在同一稀释度下至少对3个平板进行重复计数，统计的菌落数目往往比活菌数目多答案D解析当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落，因此统计的菌落数目往往比活菌的数目少，D错误。5．(2024·宿迁高二期中)从自然界筛选嗜盐菌(好氧型)的一般步骤：采集菌样→富集培养→纯种分离→计数及性能测定。图1表示上述步骤中的一个环节，图2表示该筛选过程中一个培养基上菌落的分布情况，其中白色部分为透明圈，黑点代表大小不同的菌落。下列相关叙述正确的是()A．富集培养必须在固体培养基中进行B．图1所示的接种方法也适用于对细菌进行计数C．图2中嗜盐菌的耐盐性能最强的是乙D．按用途划分，图1所示的培养基属于鉴别培养基答案C解析富集培养一般在液体培养基中进行，A错误；图1所示的接种方法是平板划线法，该方法不适于对细菌进行计数，B错误；图2中的乙菌落的透明圈直径/菌落直径最大，说明该菌落嗜盐菌的耐盐性能最强，C正确；图1所示的培养基属于选择培养基，D错误。题组二微生物的数量测定6．(2023·无锡高二质检)养殖池中存在的有毒物质主要是氨及亚硝酸，这两种物质可被硝化细菌吸收利用。在“养殖池底泥中硝化细菌的分离和计数”实验中，下列说法正确的是()A．需要配制添加一定浓度铵盐的牛肉膏蛋白胨培养基，以筛选硝化细菌B．应对采集底泥使用的工具进行灭菌，全部接种过程均需在酒精灯火焰旁进行C．采用平板划线法进行分离和计数时，还需与未接种的空白培养基同时培养D．若空白对照组上长出了菌落，需要在实验组数据的基础上减去空白对照组的菌落数答案B解析要分离硝化细菌，应该用以铵盐为唯一氮源的培养基，培养基中不能加入牛肉膏蛋白胨，A错误；平板划线法不能用于菌落计数，C错误；若空白对照组上长出了菌落，则说明培养基被污染了，实验数据无效，需重新实验，D错误。7．下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的叙述，不正确的是()A．利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌B．两种计数方法，其统计值与实际值相比，均有差异，但产生差异的原因不同C．两种计数方法均能在计数的同时观察到所研究微生物的形态特征D．当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数答案C解析显微镜直接计数法无法区分死菌和活菌，A正确；稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故而统计值比实际值小；显微镜直接计数法计数时不能区分死菌和活菌，故测定的微生物数量往往大于实际的活菌数，因此两种计数方法其统计值与实际值相比，均有差异，但产生差异的原因不同，B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误。8．(2024·渭南高二期中)如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验示意图。据图分析，下列相关叙述错误的是()A．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管中的10倍B．5号试管中稀释液进行平板培养的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7×106个C．当样品稀释度足够高时，一般平板上一个单菌落来源于一个活菌D．某一稀释度下至少涂布3个平板，确保实验结果的准确性答案B解析5号试管中稀释液进行平板培养的结果表明，每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109(个)，B错误。9．(2021·山东，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是()A．甲菌属于解脂菌B．实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源C．可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比D．该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力答案B解析根据题干信息“甲菌菌落周围呈现深蓝色”，说明甲菌可以分泌脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，因此甲菌属于解脂菌，A正确；乙菌落周围没有出现深蓝色，说明乙菌落不能产生脂肪酶，不能利用脂肪为其供能，但乙菌落也可以在培养基上生存，说明该培养基不是以脂肪为唯一碳源，B错误；可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，更加直观，C正确；可以利用该平板来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，观察指标可以是菌落周围深蓝色圈的大小，D正确。10．(多选)筛选是分离和培养微生物新类型常用的手段，下列有关技术中能筛选成功的是()A．在全营养的LB培养基(普通培养基)中，筛选大肠杆菌B．在尿素固体培养基中，筛选能够分解尿素的微生物C．用以纤维素为唯一碳源的培养基，筛选能分解纤维素的微生物D．在培养基中加入不同浓度的氯化钠，筛选抗盐突变体的微生物答案BCD解析在全营养的LB培养基(普通培养基)中，几乎所有细菌都能生长，不能筛选大肠杆菌，A不符合题意；在尿素固体培养基中，只有能分解尿素的微生物才能生长，不能分解尿素的微生物因缺乏氮源不能生长，能够筛选分解尿素的微生物，B符合题意；在以纤维素为唯一碳源的培养基中，只有能分解纤维素的微生物才能生长，不能分解纤维素的微生物因缺乏碳源不能生长，能够筛选分解纤维素的微生物，C符合题意；在培养基中加入不同浓度的氯化钠，只有抗盐的微生物才能生长，故可用于筛选抗盐突变体的微生物，D符合题意。11．(多选)(2023·衡水高二期中)精氨酸依赖型菌株不能在缺少精氨酸的培养基上正常生长，但可作为鸟氨酸发酵的优良菌种。如图为野生型谷氨酸棒状杆菌经诱变获得精氨酸依赖型菌并进行筛选的过程示意图。下列相关叙述正确的是()A．野生型菌液的培养皿中不会出现菌落B．乙培养基与甲相比可能缺少了精氨酸C．紫外线照射可导致谷氨酸棒状杆菌发生可遗传变异D．乙中的菌落A为鸟氨酸发酵的优良菌种答案ABC解析由图观察可知，乙中的菌落A是野生型菌种，菌落B为精氨酸依赖型菌株，B可作为鸟氨酸发酵的优良菌种，D错误。12．(16分)某生物兴趣小组试图探究山羊瘤胃中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能降解尿素的细菌(目的菌)。实验步骤如图所示。请回答下列问题：稀释倍数103104105106107菌落数5003672483618(1)该实验中所用培养基在成分上的特殊要求是______________________；培养基中的KH2PO4和Na2HPO4的作用有_____________________________________________________。(2)实验中采用的分离纯化细菌的方法是____________________________________________。实验过程中，除了需将接种后的平板放在适宜的环境中培养一段时间后观察，还需要设置在相同条件下培养的_______________，作为对照实验，其目的是_________________________。(3)为了计数细菌，将取自瘤胃中的液体进行稀释，接种在培养基上，放置在37℃恒温培养箱中培养24～48h，统计菌落数，结果如上表。其中________倍的稀释倍数比较适合计数。有同学认为，该计数方法统计的细菌数目会比实际数目________，他的理由是_________________