DB31∕T 1160-2019 畜禽养殖过程细菌耐药性监测技术规范

畜禽养殖过程细菌耐药性监测技术规范2019-06-14发布2019-07-01实施上海市市场监督管理局发布I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由上海市农业农村委员会提出并组织实施。本标准由上海市畜牧标准化技术委员会归口。本标准起草单位：上海市动物疫病预防控制中心。1本标准规定了畜禽养殖过程细菌耐药性监测的设备和材料、试剂和培养基、操作步骤、结果观察和记录、质量控制和结果判定、菌种保存及生物安全措施的技术要求。本标准适用于畜禽源性细菌(大肠埃希菌、沙门菌属细菌、肠球菌属细菌和金黄色葡萄球菌)分离、鉴定及常见抗菌药物敏感性试验(微量肉汤稀释法)。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求CLSIM100抗菌药物敏感性试验执行标准(PerformanceStandardsforAntimicrobialSuscepti-3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。抗菌药物敏感性试验antimicrobialsusceptibilitytesting用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制或杀灭作用的试验。药敏试验的结果通常用最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。微量肉汤稀释法brothmicrodilutionmethod定量检测某一抗菌药物对动物源性细菌的体外抑菌活性的一种标准方法。在药敏测试板上设有一系列倍比稀释浓度的抗菌药物，通过加入待检细菌的菌悬液，经一定时间的孵育后对药敏板条进行读数，经数据分析得到MIC值。根据美国临床试验室标准化委员会(CLSI)的相应标准获得待检菌对某种抗菌药物敏感(S)、中介(I)或耐药(R)的结果。使用推荐剂量时，菌株可被通常达到的抗微生物药物浓度水平所抑制。分离菌株的MIC接近于抗微生物药物在血液和组织中可达到的水平，对药物治疗的反应率可能低于敏感菌株。按常规给药计划通常可达到的药物浓度不能抑制其生长的菌株，和(或)证实其MIC值落在可能存在微生物特殊耐药机制的范围内，且治疗研究显示该药物临床疗效不可靠。2折点breakpoint用以区分菌株敏感、中介还是耐药的最低抑菌浓度或抑菌圈直径。4设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料见附录A中A.1。5试剂和培养基无菌0.85%氯化钠溶液制备方法见A.2。抗菌药物种类及贮备液和工作液的制备与保存见A.3。本标准采用的培养基如下：—营养琼脂培养基，制备见B.2;—大肠埃希菌显色培养基(麦康凯琼脂培养基),制备见B.3; 沙门氏菌显色培养基(胆硫乳琼脂培养基),制备见B.6。——肠球菌显色培养基(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基),制备见B.7。—-7.5%氯化钠肉汤，制备见B.8。 金黄色葡萄球菌显色培养基(Baird-Parker琼脂培养基),制备见B.9。——Mueller-Hinton肉汤(M-H肉汤),制备见B.10。本标准中常用的质控菌株如下：——大肠埃希菌(Escherichiacoli,ATCC25922); 沙门氏菌(Salmonella,ATC——粪肠球菌(Enterococcusfaecal 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC29213)。质控菌株使用的代次应为3代~5代，-60℃以下超低温冰箱保存。6操作步骤灭菌棉拭子一端插入家畜肛门或家禽泄殖腔1.5cm~2.0cm,旋转2圈~3圈，沾上粪便后，将棉3拭子置于10mL运送培养基中。将储奶罐中的生鲜乳搅拌均匀，使用无菌采样管采集生鲜乳100mL。样品采集时应填写采样登记表，参见附录C。6.2样品保存与运送采集的样品于0℃~4℃保存，并使用密封保温容器运送。粪便拭子保存时间不超过48h,生鲜乳样品保存时间不超过24h。6.3细菌分离与鉴定不同细菌的分离鉴定按下述方法进行：——沙门氏菌属细菌分离与鉴定见D.2;——肠球菌属细菌分离与鉴定见D.3;——金黄色葡萄球菌分离与鉴定见D.4。6.4药敏试验当药敏试验使用商品化试剂盒时，参照试剂盒说明书进行操作。当药敏试验使用自配药敏板时，按照6.4.2～6.4.6进行操作。将质控菌株和测试菌株分别转种于营养琼脂培养基，36℃±1℃培养18h~24h以得到单个纯6.4.396孔药敏板准备将抗菌药物贮备液用无菌0.85%氯化钠溶液或M-H肉汤按附录A稀释至工作浓度，使用同样稀释液按倍比稀释法进一步稀释至一系列所需浓度，然后按顺序加入无菌孔板中，每孔50μL。分别设阴性和阳性对照孔。无菌棉签用生理盐水润湿后，挑取培养18h~24h的纯菌落3个~5个，转移至含2mL~3mL无菌0.85%氯化钠溶液或M-H肉汤的试管中混匀，用浊度仪或标准比浊管校正菌液浓度至0.5麦氏单位(细菌含量约为1×10⁸CFU/mL~2×10⁸CFU/mL),将调节至0.5麦氏单位的菌液用M-H肉汤稀释100倍，混匀备用，调制好浓度的菌液应在15min内完成加样。阴性对照孔中加入无菌M-H肉汤100μL,阳性对照孔中加入制备好的菌液(用前混匀)100μL,其余孔分别加入制备菌液50μL,盖上无菌盖并标记菌株编号。4将接种完毕的96孔药敏板置于36℃±1℃恒温培养箱中，孵育16h~20h。7结果观察和记录7.1药敏板判读方法自培养箱中取出药敏板，置于衬有黑底板的光线下用肉眼观察结果。如果无法辨别孔中是否有细菌生长时可使用观察装置帮助进行结果的判读。在无菌生长的孔内所含最低抗菌药物溶液的浓度如药敏板上阴性对照孔内无细菌生长，液体未见浑浊；阳性对照孔内有敏板结果有效，可继续判读菌株MIC。如阴性孔或阳性孔异常，则该药敏板结果无效。7.2.2质控菌株符合性判断如药敏板结果有效，且质控菌株MIC在规定范围内，则本次试验结果有效，可继续判读样品药敏结果。如质控菌株MIC不在规定范围内，则本次试验结果无效。先进行试验结果有效性判断，在试验结果有效的前提下，继续判读样品MIC,判读完成后进行8质量控制和结果判定每次药敏试验均应采用合适的质控菌株进行质量控制，质控菌株药敏结果应符合规定范围质控菌株的实验结果符合规定的前提下，按照附录F中F1~F.3标准判定测试菌株的敏感性-—敏感(S)、中介(I)或耐药(R)。对于只给出敏感判断标准的药物，只报告其是否敏感即可。9菌种保存及生物安全措施实验分离的菌株应由具备相关资质的实验室妥善保存。实验过程及废弃物处理应严格按照GB19489中的规定执行。5——冰箱：0℃~4℃和-60℃以下；A.2光菌0.85%氯化钠溶液称取0.85g氯化钠溶于100mL蒸馏水中，115℃灭菌30min。成1000μg/mL(或最高测试浓度的10倍)的贮备液，6表A.1抗菌药物浓度范围稀释浓度范围/(μg/mL)稀释浓度范围/(μg/mL)阿莫西林阿莫西林恩诺沙星四环素头孢他定恩诺沙星甲氧苄啶甲氧苄啶多西环素替米考星乙酰甲喹7(资料性附录)培养基B.1运送培养基运输培养基成分见表B.1。表B.1运输培养基成分氯化钠磷酸二氢钠(Na₂HPO·12H₂O)氯化钙0.1g称取表B.1中各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH至8.4±0.1,分装三角瓶或试管，121℃高压灭菌15min备用。B.2营养琼脂培养基营养琼脂培养基成分见表B.2。表B.2营养琼脂培养基成分蛋白胨牛肉浸膏氯化钠称取表B.2中各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，调节pH至7.2±0.2,121℃高压灭菌15min,冷至50℃,摇匀后倾注平板。8B.3大肠埃希菌显色培养基(麦康凯琼脂培养基)B.3.1成分麦康凯琼脂培养基成分见表B.3。表B.3麦康凯琼脂培养基成分明胶胰酶水解物胨(或酪蛋白)中性红结晶紫称取表B.3中各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH至7.1±0.2,分装三角瓶或试管，121℃高压灭菌15min备用。缓冲蛋白胨水成分见表B.4。表B.4缓冲蛋白胨水成分蛋白胨氯化钠磷酸二氢钠(Na₂HPO₄·12H₂O)磷酸二氢钾(KH₂PO₄)称取表B.4中各成分溶于1000mL蒸馏水中，调节pH至7.2±0.2,分装三角瓶或试管，121℃高压灭菌15min备用。9B.5氯化镁-孔雀绿增菌液B.5.1溶液AB.5.1.1成分溶液A成分见表B.5。表B.5溶液A成分氯化钠磷酸二氢钾称取表B.5中各成分加入1000mL蒸馏水中，调节pH至7.0,加热至70℃溶解。此溶液使用前在4℃冰箱储存不超过24h。B.5.2溶液BB.5.2.1成分溶液B成分见表B.6。表B.6溶液B成分氯化镁(MgCl₂·6H₂O)按照表B.6用量将MgCl₂·6H₂O溶于1000mL蒸馏水中。B,5.3溶液CB.5.3.1成分溶液C成分见表B.7。表B.7溶液C成分按照表B.7将孔雀绿溶于100mL蒸馏水中。溶液可室温保存于棕色玻璃瓶中。完全培养基成分见表B.8。表B.8完全培养基成分溶液B溶液C按表B.8比例配制，调节pH,使灭菌后pH为5.2,分装于试管中，每管10mL。115℃高压灭菌B.6沙门氏菌显色培养基(胆硫乳琼脂培养基)B.6.1成分胆硫乳琼脂培养基成分见表B.9。表B.9胆硫乳琼脂培养基成分蛋白胨牛肉浸膏去氧胆酸钠中性红称取表B.9中除中性红和琼脂以外各成分溶于400mL蒸馏水中，调节pH至7.3±0.2,再将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸至完全溶解，两液合并，加入0.5%中性红溶液6mL,待冷至50℃,摇匀后倾B.7肠球菌显色培养基(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基)胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基成分见表B.10。表B.10胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基成分牛肉浸膏酵母浸膏牛胆粉氯化钠叠氮化钠称取表B.10中各成分溶于1000mL蒸馏水中，调节pH至7.1±0.2,121℃高压灭菌15min,于45℃~50℃保温培养基，从保温开始至倾注平板的时间不应超过4h。B.87.5%氯化钠肉汤B.8.1成分7.5%氯化钠肉汤成分见表B.11。蛋白胨牛肉浸粉氯化钠称取表B.11中各成分加热溶于1000mL蒸馏水中，调节pH至7.4±0.1,分装于三角瓶或试管，121℃高压灭菌15min备用。B.9金黄色葡萄球菌显色培养基(Baird-Parker琼脂培养基)Baird-Parker琼脂培养基成分见表B.12。表B.12Baird-Parker琼脂培养基成分牛肉音酵母膏丙酮酸钠氯化锂(LiCl·6H₂O)B.9.2增菌剂30%卵黄盐水50mL与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1%的亚碲酸钾10mL混合，4℃冰箱保存。称取表B.12中各成分至1000mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.0±0.2,分装每瓶95mL,121℃高压灭菌15min。临用时加热融化琼脂，冷至50℃,每95mL加入预热至50℃的卵黄亚硒酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在4℃冰箱储存不应超过48h。B.10Mueller-Hinton肉汤(M-H肉汤)B.10.1成分M-H肉汤的成分见表B.13。牛肉浸出粉酪蛋白水解物B.10.2制法称取表B.13各成分加入蒸馏水1000mL,搅拌加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.4±0.2,分装三角瓶，121℃高压灭菌15min,定量(等体积)分装于灭菌试管中。(资料性附录)采样登记表畜禽养殖抗菌药物使用情况采样登记表见表C.1。表C.1畜禽养殖抗菌药物使用情况采样登记表采样时间姓名电话口注射口饮水口拌料□注射□饮水口拌料□注射□饮水□拌料(资料性附录)D.1大肠埃希菌分离与鉴定棉拭子接种于大肠埃希菌显色培养基，36℃±1℃培养18h~24h,挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落，显色培养基上纯化一代，纯化后可疑菌落接种于营养琼脂培养基纯化一代。对已纯化的菌落，使用微生物生化鉴定系统或生化试条进行生化鉴定。大肠埃希菌分离与鉴定流程图见图D.1。动物肛门或泄殖腔拭子动物肛门或泄殖腔拭子运送培养基接种于大肠埃希菌显色培养基，36℃±1℃,培养18h~24h挑取大肠埃希菌可疑菌落纯化生化鉴定大肠埃希菌图D.1大肠埃希菌分离与鉴定流程图D.2沙门氏菌属细菌分离与鉴定棉拭子置于缓冲蛋白胨水中，36℃±1℃培养18h~24h,取100μL预增菌液置于10mL氯化镁-孔雀绿培养基中，42℃±1℃培养22h~24h,随后将增菌液混匀，接种于沙门氏菌显色培养基，42℃±1℃培养22h~24h,挑取沙门氏菌显色培养基上无色半透明或粉红色，菌落中心黑色或几乎全黑色的可疑菌落，接种至营养琼脂培养基纯化一代。对已纯化的菌落，应使用微生物生化鉴定系统或生化试条进行生化鉴定。沙门氏菌属细菌分离与鉴定流程图见图D.2。或者通过附录E的方法进行分子生物学运送培养基缓冲蛋白胨水预增菌，36℃±1℃,培养18h~24h接种氯化镁-孔雀绿增菌液，42℃±1℃,培养22h~24h生化鉴定PCR鉴定图D.2沙门氏菌属细菌分离与鉴定流程图D.3肠球菌属细菌分离与鉴定棉拭子接种于肠球菌显色培养基，36℃±1℃培养18h~24h,挑取褐色可疑菌落，显色培养基上纯化一代，纯化后可疑菌落接种至营养琼脂培养基纯化一代。对于已纯化的菌落，使用微生物生化鉴定系统或生化试条进行生化鉴定。肠球菌属细菌分离与鉴定流程图见图D.3。接种于肠球菌显色培养基，36℃±1℃,培养18h~24h生化鉴定图D.3肠球菌属细菌分离与鉴定流程图取1mL生鲜乳样品至9mL7.5%氯化钠肉汤中，振荡混匀后36℃±1℃培养18h~24h,将培养物划线接种到金黄色葡萄球菌显色培养基上，36C±1℃培养24h~48h,挑取灰黑色至黑色可疑菌落接种至营养琼脂培养基纯化一代。对于已纯化的菌落，使用微生物生化鉴定系统或者生化试条进行生化鉴定。金黄色葡萄球菌分离与鉴定流程图见图D.4。金黄色葡萄球菌图D.4金黄色葡萄球菌分离与鉴定流程图(资料性附录)沙门氏菌属细菌PCR鉴定E.1InvA基因引物上游为5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'下游为5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'E.2阳性菌株鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)CVCC541,或其他等效标准菌株。E.35×TBE缓冲液5×TBE缓冲液成分见表E.1。表E.15×TBE缓冲液成分乙二酸四乙酸二钠E.450×TAE缓冲液50×TAE缓冲液的成分见表E.2。表E.250×TAE缓冲液成分E.5PCR法鉴定E.5.1PCR模板的制备用接种环从营养琼脂培养基上挑选16h～24h的纯培养物，置于0.5mL灭菌生理盐水中，12000r/min离心2min,弃上清液。再加0.5mL灭菌蒸馏水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min,取上清液为PCR模板。阴性对照模板为灭菌蒸馏水，阳性对照模板由阳性菌株根据上述方法提取获得。E,5.2PCR反应体系的配制根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系，扩增片段长度为284bp。E.5.3PCR反应条件95℃预变性5min,94℃变性30s,64℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环，最后72℃延伸10min,设立阴性对照和阳性对照，按同方法扩增称取1.2g琼脂糖，加人100mL0.5×TBE(或1×TAE)缓冲液中，加入核酸染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶解后混匀倒人在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加0.5×TBE(或1×TAE)缓冲液淹没胶面，E.5.4.2加样取10μLPCR扩增产物和3μL上样缓冲液混匀后加入加样孔。E.5.4.3电泳条件电压110V,电泳时间30min。电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为沙门氏菌，必要时可通过测序来进一步确证。