生物技术概论：生物工程下游技术 生物分离技术

生物技术概论---

生物分离技术内容生物工程下游技术（生物分离技术）简介实验室常用的分离纯化技术生物工程下游技术在生物技术领域中的地位2生物工程下游技术的发展历程3生物工程下游技术（分离技术）原理4生物工程下游技术的对象及其特点1生物工程下游技术简介生物工程下游技术的一般流程5日常生活中的分离技术Bioengineering酶工程

发酵工程细胞工程蛋白质工程基因工程生物工程生物加工过程Bioprocess生物分离过程DownstreamProcessing上游下游1生物工程下游技术的对象及其特点生物技术的上中下游上游工程：实验室研究和开发阶段，包括基因、细胞、干细胞、转基因生物、组织工程等获得优良菌株、细胞系或固定化的菌体等。中游工程：中游加工以生物反应器为中心，优化和放大生产工艺。下游工程：从反应液中提取目的产物加工精制成合格产品。

生物工程下游技术之定义对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术称之为生物工程下游技术，也称为下游加工过程。1生物工程下游技术的对象及其特点

生物产品分类1

生物工程下游技术的对象及其特点医药工业抗生素血液制品天然药物甾体激素化学工业颜料

增稠剂

有机酸溶剂食品工业饮料氨基酸乳制品酶

不稳定

无热原（Pyrogen）无病毒无致敏原

常存在异构体等

原料构成成分复杂

原料液中目标产物浓度低

生物物质物理、化学敏感

存在降解目标产物的杂质生物安全杂质多浓度低1生物工程下游技术的特点化工分离技术：生物分离技术：

与传统的化学试剂的纯度概念不同，生物产物对有害物质有严格的控制，生产过程也要求有严格的管理，在最终产品中往往不允许有极微量的有害杂质存在。1生物工程下游技术的特点获得纯的化学物质在得到纯的生物物质同时，还必须关注特定杂质的去除；2生物工程下游技术在生物技术领域中的地位定位耗费关注程度下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或培养液需要经过下游加工过程才能成为成品传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的60%，而对重组ＤＮＡ生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的80%-90%。英国于1983年发起生物分离计划（BIOSEP）；1987年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国于1989年在济南召开了一次专门会议。2生物工程下游技术的定位分离技术在人类生产和生活中具有重要作用。将地球上的各种各样混合物进行分离和提纯是提高生产力和改善生活水平的一种重要途径。

分离是混合的逆过程，不能自发进行，需要作功才能实现。而且需要有专门的工艺和设备。在实际的工业生产中，目的产物往往与大量杂质混合在一起，分离的任务，就是从这些混合物中用最低的投入（物力、财力和人力），获得最高的产出（如产物的高得率、高纯度）。References-SCIjournalsJournalofChromatographyA（4.612）

JournalofSupercriticalFluids

（2.732）

JournalofMembraneScience

（4.093）3

生物工程下游技术的发展历程

古代酿造业2.第一代生物技术古代酿造业包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用，简单的下游技术。主要指19世纪60年代---20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。到20世纪上半叶，逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业（厌氧发酵），其产品相对简单，基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。

以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。

无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。3.第二代生物技术

以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。

生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程取得了长足进步，一批高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素等。80年代，发现了一大批生理功能性物质，如活性糖质、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。1988年，日本由40多家公司组建高度分离系统技术研究联合体，瑞典的Pharmacia，Alfa-Laval等组建了Biolink公司，加强在生物工业下游技术领域的研究开发力量，不断推出新技术、新产品、新装备，以抢占更多的市场。新技术有超临界CO2萃取技术、膜过滤、渗透蒸发技术、各种色谱（层析）技术等。4.第三代生物技术化学性质生物性质物理性质4

生物分离技术的依据分离

依据

荷电特性、电荷分布、等电点、磁性

黏度、分子扩散系数、热扩散

溶解度、挥发度、表面活性

溶质密度、尺寸和形状力学热力学传递电磁过滤、离心结晶、萃取膜分离电泳、离子交换（1）

物理性质4

生物分离技术的依据按生物分离所依据物质性质的差异分类4

生物分离技术原理

--根据目标物质的物理学性质

过滤离子交换萃取4

生物分离技术原理

--根据目标物质的物理学性质离心分离干燥箱（烘箱）4

生物分离技术原理

--根据目标物质的物理学性质旋转蒸发仪4

生物分离技术原理

--根据目标物质的物理学性质膜分离化学性质（2）（3）生物学特性1特异性相互作用2亲和作用1化学反应：热力学-化学平衡、反应动力学-反应平衡、光化学-激光激发作用等2化学性分子识别：金属离子螯合、环糊精分离挥发物质4

生物分离技术的依据发酵液处理细胞破碎固液分离色谱结晶色谱萃取沉淀吸附离子交换超临界流体预处理

分离

纯化

精制

Pre-treatmentSeparationPurificationPolishing4生物工程下游技术的一般流程清液-胞外产物分离（沉淀、萃取、膜分离、吸附）原料细胞分离（离心、过滤）细胞-胞内产物细胞破碎（高压匀浆、珠磨、冻融）碎片分离（离心、微滤）纯化（色谱、结晶）精制（色谱）成品（干燥、无菌过滤、成型）[路线1][路线2][路线1a][路线1b]包含体溶解（变性剂、表面活性剂）复性（稀释、透析、色谱）5生物工程下游技术的一般流程常用分离技术举例1.固液分离2.沉淀3.萃取5.膜分离4.色谱一、固液分离发酵液一、固液分离目的1.收集含胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相2.收集含目标产物的液相，除去固体悬浮物常用方法分离筛离心悬浮分离过滤重力沉降选择依据主要取决于细胞或菌体的大小和形状，及介质的黏度。丝状菌体型大，过滤；细菌和酵母菌个体小，离心细胞培养液的黏度；固液分离速度与黏度成反比其它因素，如pH、温度、加热时间等1.过滤原理：利用多孔型介质截留固液悬浮物中的固体颗粒，从而实现分离。过滤

过滤阻力介质阻力滤饼阻力

过滤的推动力悬浮液自身压力差、重力2.

悬浮液表面加压3.过滤介质下方抽真空1.过滤

斗架烧杯玻璃棒，滤纸漏斗角一样：“斗”指漏斗；“架”指漏斗架。这两句点明了过滤操作实验所需要的仪器：漏斗、漏斗架、烧杯、玻璃棒、滤纸，并且强调滤纸折叠的角度要与漏斗的角度一样。过滤之前要静置：在过滤之前须将液体静置一会儿，使固体和液体充分分离。三靠两低不要忘：在过滤时不要忘记了三靠两低。“三靠”的意思是指漏斗颈的末端要靠在承接滤液的烧杯壁上，要使玻璃棒的底端靠在滤纸上，盛过滤液的烧杯嘴要靠在玻璃棒上；“两低”的意思是说滤纸边缘应略低于漏斗的边缘，所倒入的滤液的液面应略低于滤纸的边缘。斗架烧杯玻璃棒，滤纸漏斗角一样。过滤之前要静置，三靠两低不要忘。过滤操作口诀常用过滤设备过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。优点缺点板框式压滤机

不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。

定义悬浮粒子与周围溶液存在密度差，在离心力作用下，不同密度的粒子进行分离的技术。常用离心机

碟式离心机

管式离心机

倾斜式离心机

优缺点优点：分离速度快，效率高、液相澄清度好缺点：设备投资高、能耗大常用方法差速离心区带离心2.离心分离离心分离离心机种类

常速离心机高速离心机超速离心机

离心机的种类和适用范围斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机；指离心管腔与转轴成一定倾角的转子。

平抛式离心机平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。

浓缩通过沉淀使目的产物由液相变成固相，浓缩倍数可达几十倍至数百倍；纯化通过沉淀固液分相后，除去留在液相（如果目的产物是固相）或沉积在固相中（目的产物留在液相）的杂质。

二、沉淀（precipitation）溶液中加入沉淀剂使溶质（目标产物）溶解度降低，形成固相从溶液中析出从而达到分离的一种技术。二、沉淀（precipitation）常用方法操作方式操作步骤盐析高聚物沉淀有机溶剂沉淀高聚物电解质沉淀等电点沉淀连续法间歇法加入沉淀剂；沉析物的陈化，促进粒子生长；离心或过滤，收集沉析物。二、沉淀法（precipitation）沉淀分级沉淀剂和原理操作范围应用有机溶剂加入低碳醇（如甲醇、乙醇等），使体系介电常数降低加入量20~80%时生物活性物质可能变性，操作温度低多糖、蛋白质盐析采用盐饱和度20~100%蛋白质高聚物沉淀PEG1~20%蛋白质、糖和核酸高聚物电解质聚丙烯酰胺等1~20%蛋白质、多糖和核酸等电点沉淀调节pH至等电点蛋白质1.盐析（salting-out）成本低，不需要什么特别昂贵的设备;操作简单，安全；对许多生物活性物质具有稳定作用；存在产品与杂质的共沉作用，因而它只能作为初步纯化。

水溶液中的蛋白质溶解度一般在生理离子强度范围内最大，低于或高于此范围时溶解度均降低。蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析（salting-out）。盐析作用产生机理

透析液水分子大分子小分子(无机盐)透析膜盐析结束后--透析（脱盐）处于等电状态的蛋白质互相吸引，其作用可能是通过分子的疏水区域，也可能还有偶极或离子的作用。因此，调节溶液的pH至溶质的等电点，就有可能把该溶质从溶液中沉淀出来.等电点（pI）：在某一PH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH成为该氨基酸或蛋白质的等电点。2等电点沉淀操作条件疏水性较大的蛋白质使用的试剂是酸碱，易中和除去，无毒性，适应于食品类生物物质的处理。糜蛋白酶和胰蛋白酶等在等电点附近不稳定沉淀不完全低离子强度，pH≈pI适用对象优点缺点2等电点沉淀明胶明胶果冻布丁郑人买履，当年成双。一朝离别，生死茫茫。君成果冻，妾为胶囊。重逢胃壁，携手天堂。3有机溶剂沉淀优点有机溶剂密度低，便于离心分离；容易蒸发除去，不会残留在成品中；不需要脱盐处理。缺点容易引起蛋白质变性失活；必须在低温下操作；有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。亲水的有机溶剂加入后，会争夺酶、蛋白质等物质表面的水分子，使它们表面的水化层被破坏，从而分子之间更容易碰聚在一起产生沉淀。3有机溶剂沉淀常用有机溶剂：乙醇：沉析作用强、挥发性适中、无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析。丙酮：沉析作用强、用量省，但是毒性大，应用范围不广。特点：容易获取3有机溶剂沉淀1.试解释生物工程下游技术含义，并举例说明生物工程下游技术是如何影响人类生活的。2.生物制品分离过程可以划分成那几个阶段？各阶段的任务是什么？3.古人将蜂巢置于陶罐中，用绳索系住罐口，拉住绳索不断挥舞旋转，从而获得蜂蜜，这其中暗含的生物分离方法是什么，试阐述该方法的原理。4.茶杯中的金属丝网分离茶叶，滤豆浆用的棉纱布分离豆渣，这些生活中常见的现象暗含什么分离过程，并说明其原理。5.鸡蛋清可用作铅中毒或汞中毒的解毒剂，为什么？发酵液处理细胞破碎固液分离色谱结晶色谱干燥萃取沉淀吸附离子交换超临界流体预处理

分离

纯化

精制

Pre-treatmentSeparationPurificationPolishing4生物工程下游技术的一般流程除去发酵液中的不溶性固形物杂质和菌体细胞除去与产物性质差异较大的杂质，为后到精制工序创造有利条件除去与产物物理化学性质比较接近的杂质获得产品萃取：利用化合物在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂转移到另外一种溶剂中反萃取：将目标产物从有机相转入水相的萃取操作叫做反萃取（backextraction）定义第三节萃取（extraction）1842年E.-M.佩利若研究了用乙醚从硝酸溶液中萃取硝酸铀酰。1903年L.埃迪兰努用液态二氧化硫从煤油中萃取芳烃，这是萃取的第一次工业应用。20世纪40年代后期，生产核燃料的需要促进了萃取的研究开发。现今萃取已应用于石油馏分的分离和精制，铀、钍、钚的提取和纯化，有色金属、稀有金属、贵重金属的提取和分离，抗菌素、有机酸、生物碱的提取，以及废水处理等。

有机溶剂萃取（organicsolventextraction）简称溶剂萃取是石油化工、湿法冶金和生物产物分离纯化的重要手段。是利用溶剂对所要分离的组分有较高的溶解能力而使目的产物从发酵液中分离出来的过程，单纯的物理过程。1溶剂萃取（solventextraction）杂质溶质原溶剂萃取剂LightphaseHeavyphase2.固液萃取利用分子扩散原理，采用有机或无机溶剂将固体物料中的可溶性组分溶解使其进入液相，从而将其从固体物料中分离出来的操作称固液萃取，也称浸取、浸出、浸虑、溶出等。固体物料溶质载体或惰性物质液体残渣溶剂浸出液党参甘草原料来源有效成分分子量比无效成分小得多，提取时有效成分透过细胞膜而无效成分留在胞内。1.植物药材有效成分为蛋白质、激素和酶等大分子物质，需先破壁。2.动物药材全蝎鹿茸虎骨无细胞结构，直接提取3.矿物药材雄黄砒霜芒硝1896195670年代发现应用3.双水相萃取（aqueoustwo-phaseextraction）Beijerinck把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发现的。上为明胶，下为琼脂瑞典伦德大学Albertsson重新发现此体系并第一次用来提取生物物质。发展M.R.Kula等首先将双水相系统用于从细胞匀浆液中分离蛋白质和酶。现在的研究已涉及到酶、核酸、生长激素、病毒等各种物质的分离和提纯。双水相萃取（aqueoustwo-phaseextraction）因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比例(85％-95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。双水相萃取是利用物质在互不相溶的高聚物水溶液间分配系数的差异来进行萃取的方法。广泛应用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)体系。3.双水相萃取（aqueoustwo-phaseextraction）气态固态液态物质的第四态：超临界状态4.超临界流体萃取（supercriticalfluidextraction）纯物质都具有超临界状态，具有普遍性超临界流体：处于超临界状态时，气液界面消失，体系性质均一，既不是气体也不是液体，呈流体状态，故称为超临界流体。4.超临界流体萃取（supercriticalfluidextraction）在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物的到分离。极性萃取剂---乙醇、甲醇、水等；非极性萃取剂---CO2CO2由于具有合适的临界条件，又对健康无害、不燃烧、不腐蚀、价格便宜和易于处理等优点，是最常用的超临界流体萃取剂。CO2的临界点为31℃,压力7.3MPa。4.超临界流体萃取

有机物在超临界流体中溶解度的变化：低于临界压力时，几乎不溶解；高于临界压力时，溶解度随压力急剧增加。溶解度等温线四、色谱分离（chromatography）机理：利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于其物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。色谱技术的发展过程俄国植物学家Tswet首次命名1903德国Kuhn分离60多种植物色素诺贝尔奖1931气相色谱诞生诺贝尔奖1950年代高效液相色谱发展1960年代新色谱技术新固定相新检测方法专家系统未来1.色谱分离的基本原理

色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为展开(Development)，洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液(Eluate)，而展开后各组分的分布情况称为色谱

组分对固定相的亲和力：〇＞△。随着洗脱剂加入，两组分将逐渐分开，亲和力弱的“△”分子移动快，先从色谱中分离出来，亲和力强的“〇”分子后从色谱柱中出来。根据固定相形状不同柱色谱（columnchromatography）纸色谱（paperchromatography）薄层色谱（thin-layerchromatography）根据流动相不同---气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱根据操作压力不同---低压色谱(＜0.5MPa)、中压色谱(0.5～5MPa)和高压色谱(5～50MPa)。1

23色谱分类2.色谱技术的分类柱色谱分离法装置实验室常规柱色谱操作装置实验室常规柱色谱操作装置薄层色谱五、

膜分离技术膜分离过程原理：以选择性膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、压力差或电位差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。膜的厚度应在0.5mm以下，否则不能称其为膜几种膜分离技术的分离范围膜筛分分离机理电荷作用膜分离机理CELMembranePositivelychargedlysozymeNegativelychargedCEAC:Convectiveforce;E:Electrostaticforce;L:Positivelychargedlysozymelayer膜－溶质电荷相互作用溶质－溶质电荷相互作用

干燥干燥操作往往是生物产品分离的最后一步。用热能加热物料，使物料中水分蒸发后而干燥或者用冷冻法使水分结冰后升华而除去的单元操作。干燥的目的是除去某些原料、半成品及成品中的水分或溶剂，以便于加工、使用、运输、贮藏等。干燥的基本概念真空烘箱啤酒酿造典型的发酵过程举例亚洲中国传入北欧地区1.1世界啤酒发展简史9千年前公元4世纪19世纪末如今将来传入亚洲19世纪末传入我国遍及世界各地（伊斯兰国家除外）起源于中东和古埃及1.基本介绍啤酒是世界产量最大的饮料酒1.2啤酒的定义及分类按现行国家产品标准规定，啤酒定义是：“啤酒是以麦芽为主要原料，加酒花，经酵母发酵酿制而成的，含有二氧化碳气、起泡的低酒精度饮料。”

啤酒酒标上的度数与白酒上的度数不同，它并非指酒精度，它的含义为原麦汁浓度，即啤酒发酵进罐时麦汁的浓度。主要的度数有18、16、14、12、11、10、8度啤酒。日常生活中我们饮用的啤酒多为11、12度啤酒。而我们通常饮用的啤酒度数多在2.5-5度之间.

按酒精度分正常、低醇和无醇按是否有酵母分含酵母和过滤后不含按原麦汁浓度分高浓度、中浓度和低浓度按啤酒色泽分淡色、浓色和黑色按啤酒是否杀菌分熟啤酒、生啤酒和鲜啤酒按使用的酵母分上面发酵和下面发酵分类方法1.2啤酒的定义及分类1.3世界啤酒工业百威Budweiser(世界上最大的啤酒酿造商,美国人最喜爱的啤酒品牌,1876年美国)1.3世界啤酒工业嘉士伯Carlsberg(世界前七大啤酒集团,欧洲销量第一的啤酒品牌,1847年丹麦)1.3世界啤酒工业贝克Beck`s(德国第一名啤酒品牌,世界历史最悠久的啤酒品牌,16世纪的德国不来梅古城)1.3世界啤酒工业喜力HeineKen(又名海尼根,荷兰啤酒,1863年姆斯特丹)1.3世界啤酒工业科罗娜Corona(1925年墨西哥,拉丁美洲知名度最高的啤酒品牌,全球第五大品牌)1.3世界啤酒工业青岛Tsingtao(最受世界欢迎的亚洲品酒品牌,中国品牌价值排名第一，出口量排名第一的啤酒品牌,创建于1903年)1.3世界啤酒工业美乐Miller(美国第二大啤酒品牌于,1855年)1.3世界啤酒工业麒麟Kirin(占中国市场份额最大的外国啤酒品牌,日本三大啤酒公司之一1907年)1.3世界啤酒工业朝日Asahi(最早走向世界的亚洲品酒品牌,日本前三大啤酒品牌,1889年)1.3世界啤酒工业老虎(虎牌)Tiger(东南亚知名度最高的啤酒,1932年新加坡)哈尔滨啤酒作坊青岛的英德啤酒厂青啤前身.北京双合盛啤酒厂总啤酒厂数≤10总啤酒厂数≥301900190319151949现代发展简史

4000-5000年前古代啤酒1.4我国啤酒行业的发展时期年份产量/万吨特点初创期1900-19490~1原料进口，技术西方控制恢复期1949-19571~4大麦引进部分地区种植，基本自给麦芽，技术自控初步发展期1957-19664~12酒花自给，能设计小型啤酒厂，厂数增加，培养一些专业技术人才第一次发展高潮1969-197812~41专门的生产啤酒设备，啤酒饮用普及第二次发展高潮1979-198841~680中大型啤酒厂建立，合资企业起步，全国出现啤酒热第三次发展高潮1991~19991000~2000啤酒趋向大型化、集团化、三资化生产1.4我国啤酒行业的发展中国啤酒工业1青岛啤酒2燕京啤酒3雪花啤酒6山城啤酒5哈尔滨啤酒4珠江啤酒1.5啤酒生产的原料

大麦是酿造啤酒的主要原料，首先将大麦制成麦芽，然后酿酒。大麦适于酿酒的主要原因为：大麦便于发芽，可产生大量的水解酶类大麦种植遍及全球大麦的化学成分适合酿造啤酒大麦是非人类食用主粮

（1）

大麦（2）

啤酒花水苦味物质芳香物质多酚物质α-酸β-酸酒花精油赋予啤酒香味和爽口的苦味增进啤酒泡沫的持久性和稳定性在麦汁煮沸时促进蛋白质的凝固，有利于澄清大米是最常用的辅助原料。添加大米的啤酒，色泽浅、口味清爽、泡沫细腻、酒花香味突出、