TCSTC-甘蔗白条病抗性评价技术规范

Q/LB.□XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国热带作物学会提出并归口。本文件起草单位：广西大学、农业农村部农技推广技术中心、广西农业科学院本文件主要起草人：张木清、李奕莎、史梦雅、姚伟、杜金霞、李美霖、陈保善、暴怡雪、张桂英、胡琴、黄江峰、温荣辉、张积森、肖胜华、余凡、蒋洪涛、陈文晗、吴广悦甘蔗白条病抗性评价技术规范范围本文件规定了甘蔗白条病抗性评价技术的术语和定义、田间鉴定和试验设计、室内苗期鉴定和试验设定、病情调查、抗病性评价以及鉴定记载表格。本文件适用于我国非主要农作物品种登记中甘蔗品种白条病抗性鉴定和评价。本文件同时适用于我国甘蔗品种区域试验、生产试验和自然诱发鉴定中的甘蔗白条病的病情调查和抗性评价；适用于甘蔗品种、品系及种质资源对甘蔗白条病抗性的田间评价和室内鉴定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1784-2009农作物品种试验技术规程甘蔗NY/T3925-2021农作物品种试验规范糖料作物术语和定义下列术语和定义适用于本部分3.1甘蔗白条病（Sugarcaneleafscald）甘蔗白条病主要是由甘蔗白条黄单胞菌（Xanthomonasalbilineans）引起的，甘蔗白条病症状为叶片上的线条、条纹类似于直铅笔线，宽度可达1厘米，逐渐沿着叶片展开，叶片上的颜色由白色变为黄色，变得更具扩散性；叶片尖端枯萎和向内卷曲，形成一种细长的枝条外观，成熟茎枯萎，看起来像缺水一样；在成熟的侵染茎上，侧芽表现出与主茎相同的症状。感染茎的纵截面特点是节点和节间出现明显的红色（附图1）。3.2田间评价（Fieldevaluation）通过对田间种植甘蔗并在特定时期进行田间调查评价3.3病原分离物（Pathogenicisolate）采用人工分离培养的方法，从病健交界处分离获得病原物的纯培养物。3.4鉴别寄主（Diagnostichost）用于鉴定病原物的甘蔗品种、品系材料。3.5（致病性Pathogenicity）病原物具有破坏寄主植物引起病变的能力3.6（培养基Medium）用于培养病原物的人工配制基质3.7接种体（Inoculum）用于接种可以引起病害的病原物。3.8接种悬浮液（Inoculumsuspension）用于接种的含有定量接种体的液体。2.9自然发病(Naturalinfection)在未经人工接种情况下发病。3.10人工接种（Artificialinoculation）在适宜条件下，通过人工操作将接种体置于植物体的适当部位并使之发病的过程。3.11发病率（发病程度）（Diseaseincidence）发病率（或者普遍率）是指发病的普遍程度，用发病株树占调查总株数的百分率。3.12病情级别（Diseaseratingscale）人为定量植物个体或群体发病程度的数值化描述。3.13病害指数（Diseaseindex)通过对植株个体发病程度（病情级别）数值的计算所获得的群体发病程度的数值化描述形式。3.14抗病性（Diseaseresistance）植物体所具有的能够减轻或克服病原物致病作用的可遗传形状。3.15抗病性鉴定（Identificationofdiseaseresistance）通过适宜技术方法鉴定植物对特定病害的抵抗水平。3.16抗性评价(Evaluationfordiseaseresistance)根据采用的技术标准判别植物对特定病害反应的程度和抵抗水平的描述。4病原物4.1病原物来源用细菌培养的方法从病叶上分离白条病病原物。经分离鉴定，我国目前优势菌株为JGT43，保存在广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室。4.2接种体组成将分离纯化好的菌株接种到XAS液体培养基中，28ºC摇床震荡培养5天后，离心去上清培养液，用无菌水把菌液配制成浓度为1×106CFU/ml悬浮液。4.3病原物鉴定利用甘蔗白条黄单胞菌的特异引物XAF/XAR进行PCR鉴定。（XAR5’-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3’，XAF5’-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3’）。4甘蔗白条黄单胞菌的繁殖和保存4.4.1甘蔗白条黄单胞菌的繁殖将保存好的菌株活化到XAS培养基平皿上，置于28度培养2天，再用无菌牙签挑取平板上的菌落，接种于液体培养基中培养，28度摇床培养2天，接种体生长至指数生长期。4.4.2甘蔗白条黄单胞菌的采集和保存采集的白条病菌用ddH2O保存于-80℃超低温冰箱进行长期保存。5鉴定5.1室内苗期抗性鉴定5.1.1截头法鉴定待鉴定甘蔗长到5个节间后，用蘸有细菌悬浮液的剪刀剪切甘蔗生长点上方，不同基因型剪切后用酒精棉擦拭剪刀，随后用棉花吸取500μl细菌悬浮液置于斜切面上，同时用无菌水作阴性对照。5.1.2浸种法鉴定甘蔗砍成单芽，种茎浸没于细菌悬浮液中3小时后再种植，待甘蔗长到五叶期即可观察到病症。此方法模拟自然环境下的侵染，评价鉴定结果与田间自然发病一致。5.2田间鉴定5.2.1田间鉴定圃田间鉴定圃设置在甘蔗白条病人工营造抗性鉴定圃或病害常发区域。田间鉴定病圃的栽培条件（品种、土壤类型及施肥）须均匀一致，且符合科学的农业实践（GAP），设立保护区。基于此病害发病特点，在田间管理上要保持高湿度、多灌水等造成发病的环境。5.2.2鉴定设计每个鉴定材料挑选蔗芽饱满、一致的种芽90个，经温汤脱毒处理后于春季种植在抗病鉴定圃中。试验采用完全随机区组设计，单行区，行长3.0m、行距1.2m，3次重复，每个小区每个基因型30个芽。以GT46和ROC22为感病和抗病对照种。5.2.3鉴定对照材料利用已知抗性的标准对照品种，把待测无性系的抗性与其相比较。表1甘蔗白条病抗性鉴别品种抗性类别鉴别品种高抗（HR）中蔗1号、粤糖93-159抗（R）新台糖22号、桂糖92-66中抗（MR）柳城05-136、ROC25感（S）福农0335、GT02-390高感（HS）桂糖46、粤甘245.2.4调查时间病害调查时间为7-9月份5.2.5调查方法每小区调查中间2行，用目测法评估叶片和蔗茎的发病程度，记录调查的总株数、病株数及病级。6病害调查6.1调查时期和方法在甘蔗伸长初期（6月）、中期（7月）和盛期（8月）各调查一次；调查时目测每份鉴定品种群体的发病状况，调查发病率，根据6.5对接种材料逐株进行调查并记载病情级别（发病率及严重度）。6.2最高病情级别个体确认每个品种（系）取三次次调查结果的最大值。根据病害症状描述，逐份材料进行调查并记载病情级别。如每个重复最高病情级别植株只有少数几株，就需要对该株甘蔗主要特征特性与本品种典型特征特性进行比较，在确认符合本品种典型性后，该株甘蔗所表现出的病情级别就作为划分该品种（材料）抗性类别的主要依据。如该株甘蔗不符合本品种典型性，应不记载病情。按上述规定逐株向下确认，直到某病情级别被确认为止。6.3鉴定调查记载表要有鉴定人员和复核人员签字。在开展鉴定调查时，鉴定人员与复核人员一同进行，鉴定人员对鉴定植株病情级别进行判断，经复核人员确认后记载。6.4抗性分离记载若一个鉴定群体中出现明显的抗、感类型，应在调查表中注明“抗性分离”，用/表示。6.5病情级别划分标准表2甘蔗白条病等级划分标准病情等级症状描述0级无症状1级(FL)1-2个铅笔状发病叶2级(ML)多于两个铅笔状发病叶3级(CB)黄化叶片4级(N)叶片坏死5级(D)植株死亡6.6病情记载及病情指数调查记录每一鉴定的植株的病情级别，按公式计算病情指数7抗病性评价7.1抗性类别划分标准7.1.1截头法抗性评价标准采用截头法人工接种，采用强致病株系JG43接种，依据接种后52天的鉴定材料最高病情指数确定抗性水平，划分标准见表3表3截头法接种抗性评价标准抗性级别病情指数抗性类别1DI≤10.0高抗（HR）210.0<DI≤30.0抗（R）330.0<DI≤40.0中抗（MR）440.0<DI≤50.0感（S）5DI>50.0高感（HS）7.1.2田间抗性评价标准依据鉴定材料多年多次的最高发病率和病情指数确定抗性水平，划分标准见表4

表4田间抗性评价标准抗性级别病情指数抗性类别1DI≤1.0高抗（HR）21.0<DI≤2.5抗（R）32.5<DI≤5.0中抗（MR）45.0<DI≤10.0感（S）5DI>10.0高感（HS）7.2有效性判别对照感病品种或任一鉴定品种的抗性级别达到高感级别（4），该批次鉴定有效。7.3重复鉴定参考鉴定品种的抗性级别，同一鉴定品种的抗性级别一年为感（3），另一年在抗或者高抗，如果两年抗性级别相差2个级别以上（包括2个级别）的，则需要做第三次抗性鉴定。或一年在高感（4），另一年在抗或高抗，则需要做第三次抗性鉴定。7.4抗性评价7.4.1在有3年（次）鉴定的结果中，如有2年的抗性类别是一致的，则此抗性类别作为最终鉴定结论。7.4.2达到高抗-抗或感-高感类别的鉴定品种，当两年抗性类别不一致时，以记载的被确认的最高病情级别所对应的抗性类别为准。7.4.3参考感病鉴定品种，人工接种鉴定，同一鉴定品种的抗性级别一年为感级，一年在抗或高抗，如果两年抗性级别相差1个等级，取抗性级数值别较大的鉴定结果，对照7.1标准重新划分抗性类别；如果两年抗性级别相差2个级别以上（包括2个级别）的，则需要做第三次抗性鉴定，取位于中间的抗性级别，重新划分抗性类别。8鉴定报告8.1人工接种鉴定一般以鉴定品种对特定生态区内优势种或不同产区优势种的混合接种体的反应出具鉴定报告。鉴定报告一般以单个品种单独出具。如集中批量送样的，也可以多个品种出一份报告。8.2鉴定报告要盖鉴定单位公章，要有制表人、复核人和签发人签字。

附录A（资料性）A.1甘蔗白条病病原菌1.1学名和形态描述白条黄单胞杆菌（Xanthomonasalbilineans），其菌落颜色是蜜黄色，菌体光亮、平滑、质地为粘稠状（图1A）；菌体为杆状细长，极生单根鞭毛（图1B）。图1白条黄单胞杆菌的菌落和电镜形态1.2病原菌鉴定1.2.1分离病原菌取病健交界处（病斑与健康部分的交界处）的甘蔗叶片，剪成边长为0.3-1.5cm大小的长方形叶片，在超净工作台中，将叶片置于0.1%升汞中灭菌30秒钟，而后在70%的酒精溶液中浸泡30秒钟，最后无菌水清洗三遍，置于灭菌滤纸上自然晾干，用无菌剪刀剪碎叶片，再用镊子夹起碎片置于含有1ml无菌水的1.5ml离心管中，使叶片浸没于水中使细菌释放到水中，室温放置4h后，按照1：100稀释后涂布于含抗生素的XAS培养基上（每升培养基加100mgCycloheximide,2mgBenomyl,25mgCephalexin,30mgNovobiocin,50mgKasugamycin），将培养基置于28ºC温箱倒置培养7天。1.2.2培养纯化待菌落长出后，挑取不同形态的菌落进行划线纯化培养，28ºC倒置培养2-3天后，纯化3-4代，直到菌株是纯的。1.2.3菌丝体的制备：在无菌操作的条件下，取二代纯化后的培养平板，使用灭菌的无菌枪头挑取单个菌落边缘菌丝置于XAS液体培养基中，于28ºC下进行振荡培养，振荡速度为250r/min，培养3-4天。1.2.4菌株保存及病原菌基因组DNA的提取无菌操作条件下，吸取带菌丝的菌液400μl于2ml离心管中，加入等体积的50%的甘油混匀，用封口膜密封，置于-80ºC保存菌株。基因组DNA使用细菌基因组试剂盒提取。1.2.5PCRPCR反应所采用的Taq酶购自大连宝生（TaKaRa），利用甘蔗白条黄单胞菌的特异引物XAF/XAR进行PCR鉴定（XAR5’-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3’，XAF5’-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3’）。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应总体积分别为25μl内含2×Taqmix12.5μl，引物(10μmol/L)各1.0μl，40ng模板DNA1μl，无菌水9.5μl。反应结束后，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用B