3.1.2 重组DNA技术的基本工具课件-高二下学期生物人教版选择性必修三

第三章

基因工程

第1节重组DNA技术的基本工具1.基因工程操作的必需工具有哪些？2.限制酶的作用、结果分别是什么？【思考】：

1.用限制酶获得的所需要的基因（目的基因）是否可以直接导入受体？为什么？复习回顾否，因为目的基因直接导入受体细胞，可能会被受体细胞中的酶降解或不能复制、表达。2.怎样将目的基因导入受体？本节聚焦本节聚焦重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？基因工程载体需要具备什么条件？1、基因工程中载体的作用是什么？有哪些种类？２、常用的载体是什么？其分布及本质分布是什么？

活动一：阅读教材第72页的内容，思考以下问题。一、分子运输车—载体活动二：分析载体需具备的条件。1.如果载体没有限制酶切割位点将会怎样？有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因2.若大丽轮枝菌的质粒有多个限制酶切割位点，但会引发棉花病害，你会用它做载体吗？对受体细胞无害、易分离3.假如目的基因导入受体细胞后不能复制，转基因生物能产生预想的性状吗？能在受体细胞中稳定保存并复制4.如何确定目的基因是否进入受体细胞中了？具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞一、分子手术刀—限制酶拟核DNA质粒大肠杆菌细胞目的基因插入位点复制原点氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌及质粒结构模式图条件原因稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上有一个至多个限制酶切割位点具有特殊的标记基因无毒害作用能使目的基因稳定存在且数量可扩增可携带多个或多种外源基因便于重组DNA分子的筛选对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤1.载体需具备的条件:一、分子手术刀—限制酶核心归纳2.标记基因的筛选原理

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：一、分子手术刀—限制酶【思考1】

根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。这种说法合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。一、分子手术刀—限制酶如何提高筛选的准确性？核心归纳3．如何提高筛选的准确性

当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。一、分子手术刀—限制酶5’................pBI121

............GAATTC........3’3’................质

粒............CTTAAG........5’活动三：2.请用剪刀模拟EcoRⅠ识别下面质粒序列和切割位点进行“切割”，将切下的片段与Bt基因（目的基因）片段进行重组。

1.请将代表pBI121质粒的序列首尾黏贴在一起，模拟环化质粒。目的基因

【思考3】质粒和目的基因相同的黏性末端，碱基互补配对并形成氢键，但是DNA每一条链上各有一个缺口，该怎样处理？DNA聚合酶可以吗？新课推进活动四：阅读教材第72页的内容，思考DNA连接酶的作用，并完成下表。二、分子缝合针—DNA连接酶种类______________________________________来源大肠杆菌T4噬菌体作用差别只连接____________缝合___________和____________将双链两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。1作用：两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶种类______________________________________来源大肠杆菌T4噬菌体作用差别只连接____________缝合___________和____________E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶黏性末端黏性末端平末端（效率较低）都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。2种类：二、分子缝合针—DNA连接酶AATT

GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶旁栏思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键DNA聚合酶作用示意图：二、分子缝合针—DNA连接酶DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果 用途催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键

DNA连接酶与DNA聚合酶的比较二、分子缝合针—DNA连接酶与DNA相关的几种酶的比较项目DNA连接酶DNA聚合酶限制酶解旋酶作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键作用对象DNA片段单个的脱氧核苷酸DNADNA作用结果将两个DNA片段连接成重组DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端切割DNA分子形成黏性末端或平末端将双链DNA分子局部解旋为单链二、分子缝合针—DNA连接酶思考：各小组将活动三中所有DNA片段混合，拼接后，除了我们想要的重组质粒外，还会产生什么样的DNA分子？如何解决这些问题？目的基因与目的基因相连质粒与质粒相连（自身环化）目的基因与质粒相连双酶切新课推进反向连接正向连接错误连接

下表中列出了几种构建重组DNA分子常用的限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请据图回答下列问题：（1）构建重组DNA分子，能否用限制酶SmaⅠ酶切割质粒？为什么？不能；因为限制酶SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因，质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，则无法进一步筛选。新课推进（2）用同一种限制酶分别切割质粒和外源DNA构建重组DNA的方法，称为“单酶切法”。如使用限制酶EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，其结果如下：请分析回答：①黏性末端1与2能被DNA连接酶连接吗？黏性末端3与4呢？黏性末端1、2、3、4均相同，1与2、3与4均能被DNA连接酶连接。②黏性末端1与3、2与4能被DNA连接酶连接吗？1与4、2与3呢？黏性末端1与3、2与4、1与4、2与3均能被DNA连接酶连接。新课推进（3）用两种能产生不同黏性末端的限制酶分别同时切割质粒和外源DNA构建重组DNA的方法，称为“双酶切法”。如使用限制酶BamHⅠ和HindⅢ分别同时切割质粒和外源DNA，结果如下：请分析回答：①黏性末端1与2能被DNA连接酶连接吗？黏性末端3与4呢？

②黏性末端1与3、2与4能被DNA连接酶连接吗？1与4、2与3呢？（4）通过上述分析，与“单酶切法”相比，“双酶切法”有何优点？可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与质粒的反向连接。黏性末端1与2、3与4均不能被DNA连接酶连接。黏性末端1与3、2与4均能被DNA连接酶连接，但1与4、2与3均不能被DNA连接酶连接。新课推进限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类:磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：

磷酸二酯键种类：

E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：

把两条双链DNA片段拼接起来

课堂小结1.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。目的基因质粒上的抗生素抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中课堂练习（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入Ps