《壳聚糖-纳米硒的制备工艺研究》15000字（论文）

第第页壳聚糖-纳米硒的制备工艺研究【摘要】:纳米硒，比较无机硒和有机硒而言，具有的优点有毒性低，易吸收，安全高效等，在饲料、保健、医药等领域拥有着广泛的应用前景。但纳米硒由于粒径小而容易团聚，从而影响其生物效能，采用壳聚糖作为生物模板，可将纳米硒进行包裹固定，避免团聚，提高稳定性。本实验通过优化壳聚糖模板法对于纳米硒制备方法，对壳聚糖用量，温度，Vc用量，亚硒酸钠用量，反应时间，进行研究，以粒径为指标，采用Zeta电位仪进行测量，进而在单因素实验基础对实验结果分析，再使用Box-BenhnkenDesign对壳聚糖模板法制备纳米硒实验进行三因素三水平响应面的优化设计，数据显示，纳米硒粒径影响程度从大到小依次为壳聚糖(A)，温度(C)和Vc投加量(B)，最佳条件为：壳聚糖为0.006g,Vc投加量与亚硒酸钠投加量为5:1，温度为35oC。本实验在这个最佳条件下，制备的最佳纳米硒粒径为116nm。【关键词】：壳聚糖、纳米硒、生物模板法目录第一章绪论 71.1研究背景 71.2壳聚糖 71.2.1壳聚糖的概述 71.2.2壳聚糖研究现状 71.3硒 81.3.1有机硒 81.3.2无机硒 81.3.3纳米硒 81.3.4纳米硒比较优势 91.4纳米硒的作用 91.4.1免疫与抗氧化 91.4.2抗菌 101.4.3抗肿瘤 101.4.4保健 101.4.5解毒 101.4.6促进生长 111.5纳米硒的制备方法 111.5.1化学法 111.5.2物理法 121.5.3生物法 121.6壳聚糖制备纳米硒 13第二章实验材料、仪器和步骤 142.1实验设备与实验材料 142.1.1实验设备 142.1.2实验材料 142.2定性分析实验 142.2.1电镜及能谱测试 152.2.2红外光谱 152.2.3紫外光谱 152.3设计单因素实验 152.3.1壳聚糖质量 152.3.2反应温度 16第三章实验数据分析与讨论 183.1材料定性 183.1.1壳聚糖模板法制备纳米硒电镜与能谱 183.1.2紫外全波长扫描图 203.2单因素实验数据分析与讨论 213.2.1壳聚糖对纳米硒粒径的影响分析 213.2.2温度对纳米硒粒径的影响分析 223.2.3亚硒酸钠对纳米硒粒径的影响分析 233.2.4Vc对纳米硒粒径的影响分析 243.2.5反应时间对纳米硒粒径的影响分析 253.2.6超声对纳米硒粒径的影响分析 263.4响应面法优化实验 263.4.1优化实验变量 263.4.2Box-BenhnkenDesign优化壳聚糖模板法制备纳米硒实验 273.4.3实验模型的分析 28第四章结论与展望 324.1结论 324.2展望 33参考文献 36第一章绪论1.1研究背景硒,一种人和动物的必需元素之一，对植物的生长方面也有一定的积极作用。在医学和营养领域，硒更是拥有“天然解毒剂”“抗癌之王”等的美称。然而，硒不能由身体本身进行合成，从食物中获得的硒成为了补充机体硒的重要来源。此外，中国也是一个缺硒大国。根据土地调查结果的结果显示，我国72%的地区属于缺硒和低硒地区[1]。据调查在福建的耕地中，有近四分之一的区域可以发展富硒农业，产业开发潜力巨大，发展富硒农业已成为发挥我省特色农业优势的一个重要举措，对于建设现代化农业，是对群众消费新需求的适应性举措和促进农民收入提高的重要切入点[2]。然而，天然富硒产品具有较大的不确定性，在科学种植、科学养殖、硒含量可以精确控制等方面，存在天然不足。农产品存在硒含量波动大、确定性低等问题[3]。因此，如何进行高效、稳定的制备纳米级的硒成为十分关键的问题。1.2壳聚糖1.2.1壳聚糖的概述作为一种十分有利用价值的多糖资源的壳聚糖，它属于甲壳素脱乙酰衍生物。其组成的基团包括羟基和氨基，可以与金属离子配位[4,5]，具有反应活性。属于天然高分子化合物。壳聚糖拥有独特的生理功能比如生物黏附性、生物相容性和无毒性，使其存在广阔的应用的空间[6]。1.2.2壳聚糖研究现状溶解性:壳聚糖存在一些问题，如溶解性较差，具体表现为在稀酸中只有少量溶解，在有机溶剂中不可溶解，在水中也不溶解，纳米技术级物质硒的规模化生产制备受大分子物质的活性研究影响，而制备壳聚糖载体的方法被酸性环境所限制，限制了大分子物质的活性[6]。降解性:生物降解性这一性质在壳聚糖中表现出较低的情况，在一些研究结果显示，虽然壳聚糖拥有一定的降解性，但降解速度在壳聚糖中的体现与受到溶菌酶催化的壳聚糖降解速度的体现相比较，壳聚糖与氨甲喋呤结合物降解的速度存在不充分且较慢的现象，可能积聚在生物体内[6]。亲水性:壳聚糖包裹的只能是一些亲水性大分子，很难成为疏水性物质的载体[6]。1.3硒1.3.1有机硒有机硒为含硒生物大分子物质，由硒小分子如硒代蛋氨酸，硒代半胱氨酸等和硫，碳等原子结合而成[7]。生物活性和安全性较高，毒性较低，主要的转化途径是通过动植物的生物转化,因此存在转化所需时间较长的缺点[7]。检测方法:(1)高效液相色谱质谱联用法：使用液相分离的方法，以及把母离子分为子离子,可以检测较多的有机硒[8]。(2)高效液相串联电感耦合等离子色谱法:利用DRC-ICP-MS和阴离子交换色谱联用技术,进行检测[9]。1.3.2无机硒无机硒包含有亚硒酸钠，硒酸和其他无机形态[10]，虽然价格较低，来源广，但是毒性高，且拥有一个十分相近的中毒量和需要量的界限[11]，不易被生物利用，化学活性低，安全有效剂量范围狭窄。检测方法:(1)石墨炉原子吸收法:经过混酸消解的样品，在石墨炉中样品硒形成的基态原子吸收特征电磁辐射，将样品的吸光度与标准溶液的吸光度对比，得出硒含量[12]。(2)比色法:在混酸消解后的试样，在酸性的环境下，3,3-二氨联苯胺与四价硒形成黄色化合物，在pH为7的条件下，受到甲苯萃取的作用，在通过比色进行硒含量进行定量检测[12]。1.3.3纳米硒纳米硒就是纳米级的单质硒，拥有红色的外观，具有生物活性高，低毒性，可以被生物体较好的吸收和利用的特点[6]。检测方法:敞口湿法消解，微波辅助密闭消解：反复加热回流或微波消解混合酸或者强氧化剂或者混合酸。混有混合酸的试样消化过夜之后，第二天用电热板进行反复的加热，由此对其进行前处理，将零价的硒转化为四价硒，再进行除酸的操作，随后通过高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱进行测定[13]。1.3.4纳米硒比较优势一方面，单质硒的颜色有灰色，红色，黑色之分，其中当单质硒表现为灰色或黑色时，不存在其他生物化学活性，而且无法被生物所利用[14]。相比于传统的硒而言，纳米级的具有高生物活性的优势，对于中毒剂量与营养剂量范围过窄的问题解决可以起到一定的作用，因为生物功效特别是在体内去除羟自由基效率的生物功效这方面，纳米硒的功效最好，纳米硒的功效是无机硒的5倍，是有机硒的2.5倍[15]。生物学效应主要是通过纳米硒的粒径大小来体现，因此是制备纳米硒的重要指标之一就是粒径。一些研究的结果表明，5-200nm的纳米硒粒径状态下，生物学效应明显[14]。比如Huang[16]等以聚乙烯醇为模板，采用化学法还原二氧化硒，制成的纳米硒具有明显的抑菌作用。另外，在进行关于急性毒性剂量进行研究时，纳米硒半数致死量为1.13×10-4g/kg无机硒的半数致死量为1.5×10-4g/kg,有机硒半数致死量为3.5×10-4g/kg[15]，从研究中可以看出，纳米硒与有机硒和无机硒相比较，纳米硒具有安全性较高的优点。此外，纳米硒过量对生物来说没有一个明显的毒性。因此，纳米硒高活性、低毒性的优势极有希望成为最佳补硒产品被大众所欢迎[17]。1.4纳米硒的作用1.4.1免疫与抗氧化作为硒生化作用的基础的抗氧化，在硒的生化作用中起着最重要的作用，主要作用的物质是ROS及其衍生物[6]。机体抗氧化性的高低直接受机体硒水平的影响，机体的免疫和疾病抵抗力也会受到影响。周艳辉[17]等人制取纳米硒，得到具有良好清除超氧阴离子的蔗糖溶胶纳米硒体系的结果就是通过在制备纳米硒时，研究其抗氧化活性，使用蔗糖作为表面修饰剂进行制取的。1.4.2抗菌硒蛋白拥有抗细菌活性，更具有抗真菌作用，硒纳米颗粒的作用机制主要包含：对细菌细胞膜完整性的破坏，对破坏细胞成分活性氧产生的促进作用，对线粒体成分进行破坏，进而中断能量的传递过程，对DNA合成过程的抑制，对金属离子进行释放，进而对微生物产生毒害作用[18]。1.4.3抗肿瘤通过不断地探索研究，提出了一些有关纳米硒抗癌的假说:纳米硒可以对细胞周期进行阻滞作用，对癌细胞进行凋亡诱导，对致癌物的代谢途径进行调整控制，对宿主自身的免疫力功能进行加强[18]，各作用机制之间相互联系，共同承担起抗癌的作用。而探究出虽然竹荪多糖纳米硒不能起到诱导癌细胞直接凋亡的作用，但是对于人肝癌细胞和人胃癌细胞有明显的抑制它们增殖作用是李玉红[19]等人通过对竹荪多糖纳米硒对人胃癌细胞和人肝癌细胞抗癌活性的关系所获得的结果1.4.4保健纳米硒拥有促进机体的防病和抗病的能力，促进机体保持健康是可以通过刺激生物的体液，细胞，非特异性指标的方法获得[18]。比如对纳米硒对甲状腺，白内障等疾病存在抑制作用，甚至在某些疾病治疗过程，硒可以作为一项重要的治疗药剂。从这个角度来说，纳米硒可视为一种具有突出的保健作用的免疫调节剂[18]。1.4.5解毒硒存在解毒的作用，其主要原因硒具有与金属较强亲和能力，通过结合生物体内重金属为硒蛋白质复合物，而后促进金属从体内排出，起到解毒的效果。还可以对于脂质过氧化的损伤起到保护的作用，更可以对某些元素诱突变毒性和遗传毒性进行拮抗[6]。1.4.6促进生长经过大量动物的实验研究，其结果表明，对畜禽来说，硒具有较高的促生长功能。硒缺乏导致组织中的三碘甲腺原氨酸的含量以及机体血清含量相对于正常的动物来说偏低。而是一种控制生长激素合成的物质，还能对胰岛素水平进行提高，从一定程度上来说，对生产有促进作用。加硒的三碘甲腺原氨酸可以提高三碘甲腺原氨酸的含量，进而促进生长发育[6]。1.5纳米硒的制备方法1.5.1化学法制备过程中加入稳定剂（如蛋白质，多糖，淀粉等）和还原性试剂（抗坏血酸，硫代硫酸钠，碘化钾等）[20,21]，从而制取出粒径分散较好的纳米硒物质。(1)水热反应法即在高温，高压的条件之下，进行水解反应制备纳米级硒物质。对于纳米硒的晶体结构有影响因素包括时间，PH,温度等。制取的纳米硒颗粒拥有良好的分散性和结晶性，而且最重不用高温灼烧可以获得产物[22]。比如，王百木等人[23]的纳米硒制备中，将聚乙烯醇加入HAc-NaAc缓冲液体系中，利用亚硒酸钠以制备水热反应的前驱体，而后经过水热处理，制取稳定，获得率高的纳米硒棒。(2)模板法纳米硒制备主要通过选取合适结构与尺寸的模板进行制取。按照作用机理对纳米硒的模板进行分类，即可将模板分为软模板法，硬模板法。硬模板法的模板是材料的内表面或者外表面，可以在纳米硒的大小和尺寸方面起调控的作用，利用在模板中的单体进行化学反应，电化学反应，通过对于时间的控制进而控制纳米硒粒径的大小，最后，去除模板获得纳米硒。从一定程度上，硬模板法让工艺流程增加，可能会对纳米硒的结构有破坏的作用。软模板法主要是有高分子柔性模板，液晶模板，生物分子模板，反胶束模板[23]。在制备纳米硒的实验中，郑小凤等人[24,25]选用桔梗多糖为模板，以Vc和Na2Se03为材料进行制取。为获取粒径均匀的纳米硒，李晓芳等人[26]以羟甲基壳聚糖为模板，使用抗坏血酸,亚硒酸钠为原料进行对纳米硒物质的制备。(3)光化学合成法这方法指通过利用光反应，使得活性强的水合电子和产生的还原性和活性强的羟基自由基和氧化性和进行反应，制备纳米硒颗粒。该方法的优点在于在制备的操作的反应控制与其他方法相比，较为简单，操作容易[23]。(4)微乳液法这种方法是将两种互不相溶的液体进行混合操作，在表面活性剂的作用下，产生一种具有宏观上均匀微观上不均匀特点的体系。可以通过对沉淀剂用量大小，反应物之比等来调控纳米硒的大小。具有操作简便，制备的纳米硒粒径可以控制的优点[23]。(5)表面活性剂合成法这是一种利用化学反应得到保持在胶核尺度的溶胶的一种方法。主要过程是在这个反应中生成不溶性物质，进而控制析晶。表面活性剂可以对纳米颗粒产生分散，吸附，共价作用，将纳米硒颗粒带到互不相溶的液液界面处，促进结晶形成那么一维纳米硒晶体[23]。在反应过程中，将作为表面活性剂的0.5%十六烷基三甲基溴化铵加入，Na2Se03与水合肼反应，在反应结束时，加入正丁醇，振荡后静置，会形成分界面，而在这个分界面有聚集着纳米硒颗粒的特征，然后在界面进一步合成具有一维结构特点的纳米硒，是宋吉明等[27]人为获得纳米硒颗粒所采取的方法。1.5.2物理法常用物理方法制备纳米硒主要有微波辐射法、气相沉积法和激光烧蚀法[18]。微波辐射法是利用微波技术辅助加热硒的盐溶液，经过这样一段时间即可获得纳米硒。激光烧蚀即用激光烧蚀在去离子水中的硒结晶，直接获得硒溶液。制备纳米硒粒径小且不加稳定剂也可保持较高的稳定性，而且容易收集，但是其制备过程需要用到的仪器及设备较为特殊且不易获取[18]。1.5.3生物法（1）真菌合成使用真菌合成的纳米硒可以在胞外也可以在胞内积累,但是制备的纳米硒尺寸会受到真菌种类不同的影响。作为一种相对理想的真菌载体的富硒酵母，酵母的生产周期短，可以食用，同时还存在较高的安全性和生物活性，可以利用在啤酒发酵中酵母泥与亚硒酸钠反应[28]，从而获取纳米硒颗粒。（2）细菌合成由于细菌具有较高的代谢能力和繁殖能力，同时对于营养要求低，因此是制备纳米硒一项理想的材料目前的研究表明，有好氧菌也有厌氧菌，有化能异养细菌也有光合细菌，都可以在自身菌体的胞内或胞外的多个位点对亚硒酸盐或者硒酸盐进行还原[28]，从而获得纳米硒。（3）植物法合成在制备纳米硒中，里面的植物提取物发挥着还原剂和稳定剂的作用。其中，含有维生素，氨基酸等物质的植物浸提液，具有多种官能团如氨基，羧基，多羟基等官能团。比如氨基和羧基具有强络合性的特点，多羟基有还原性强的特点。不仅可以在制备过程中避免对化学药剂的大量使用，是一种比较环保的制备方法。而且还可以对纳米硒的制备起到稳定化作用[23]。1.6壳聚糖制备纳米硒多糖拥有广泛的来源，价格也比较低廉，安全性且具有高效性。其中，壳聚糖具有明显的优点比如较高的生物降解性、生物相容性，还具有无毒和副作用等，可以通过生物大分子作用如细胞表面的磷脂使得纳米硒容易与细胞膜表面进行结合，从而促进吸收效果。在制备纳米硒的过程中，还原剂与亚硒酸盐进行反应，其中加入壳聚糖模板在使其模板上对硒原子进行吸附，从而纳米硒的聚合进行有效的阻碍，进而制备稳定状态的纳米硒，实现以化学形式转化纳米硒。在酸性介质中，一种带正电荷聚电解质与壳聚糖产生作用，构成了一个较好的微环境，存在悬浮，稳定，乳化的特点。此外，位于壳聚糖分子链上的氨基性质活泼，其原因主要是吸附能力较强。在壳聚糖的微环境中，亚硒酸以分散形式存在，然后与抗坏血酸反应，壳聚糖吸收包裹在反应中产生的硒，在初步反应时对颗粒团聚进行阻碍，有效对颗粒尺寸的增长进行减缓，获得了性能稳定的纳米硒[16]。第二章实验材料、仪器和步骤2.1实验设备与实验材料2.1.1实验设备本次研究中，实验所需使用的实验设备及其型号和生产厂家如表2-1所示。表2-1实验设备及其型号和生产厂家Table2-1Laboratoryequipmentanditsmodelandmanufacturer设备名称型号生产厂家Zeta电位仪OmicBI-ZTU美国布鲁克海文仪器公司紫外可见分光光度计UV-2600岛津仪器（苏州））有限公司电子分析天平TE124S美国康州HZ电子科技有限公司傅立叶红外光谱仪NICOLET380赛默飞世尔科技公司磁力搅拌器C-MAGHS4艾卡仪器设备有限公司形桌上显微镜TM3030PLUS日本株式会社日立高新技术那珂事业所超声清洗仪S3000东莞市墨洁超声波设备有限公司2.1.2实验材料本次研究中，实验所需使用的材料的名称、浓度及来源如表2-2所示。表2-2实验所用材料名称、浓度及来源Table2-2Thename,concentrationandsourceofthematerialusedintheexperiment序号名称浓度来源1壳聚糖BR生化试剂国药集团化学试剂有限公司2去离子水-实验室3亚硒酸钠化学纯国药集团化学试剂有限公司4抗坏血酸分析纯AR国药集团化学试剂有限公司2.2定性分析实验2.2.1电镜及能谱测试在这个实验中，称取0.01g壳聚糖，加入10ml浓度为0.01mol/l的亚硒酸钠溶液，再加入40ml浓度为0.01mol/l的Vc溶液，用玻璃棒进行搅匀，待反应2h之后，用于将溶液倒入培养皿中，放入烘箱在70℃的温度下烘干，待烘干后，用研钵捣成细粉末，用以电镜能谱的测试。在测量电镜能谱时，取少量样品固定在仪器上，再用电镜能谱在放大500倍的条件下进行测试。2.2.2红外光谱在这个实验中，称取0.01g壳聚糖，加入10ml浓度为0.01mol/l的亚硒酸钠溶液，再加入40ml浓度为0.01mol/l的Vc溶液，用玻璃棒进行搅匀，待反应2h之后，用于将溶液倒入培养皿中，放入烘箱在70℃的温度下烘干，待烘干后，用研钵捣成细粉末，用红外光谱的测试。在红外光谱测试中，将待测样品与溴化钾混合，研磨均匀之后制成薄片再分别对背景和样品进行红外光谱的测试。2.2.3紫外光谱在这个实验中，分别配制浓度10ml的0.01mol/l的Vc溶液，0.01g壳聚糖和10ml的浓度为0.01mol/l的Vc反应溶液，10ml的浓度为0.01mol/l的亚硒酸钠，0.01g壳聚糖和10ml的浓度为0.01mol/l的Vc反应溶液，10ml的浓度为0.01mol/l的亚硒酸钠和10ml的浓度为0.01mol/l的Vc反应溶液，0.01g壳聚糖溶液·,在进行稀释，通过紫外光谱在200nm至800nm的波长下进行测量。2.3设计单因素实验2.3.1壳聚糖质量在这个实验中，采用电子天平称取0.01g壳聚糖粉末，再用移液枪移取亚硒酸钠溶液置于烧杯中，每组溶液10ml,再分别往溶液中分别加入0.002g、0.01g、0.05g、0.1g、0.5g的壳聚糖粉末，充分摇匀后，待亚硒酸钠与壳聚糖反应5min后，再分别加入40mlVc,常温反应2h,由于制取的液浓度过高，因而不能直接使用制取的纳米硒溶液进行zeta电位仪的测定，因此需要在测量之前需要将溶液进行100倍的稀释。然后将制取的溶液进行摇匀，在25ml的容量瓶里，加入250ul的纳米硒溶液，再加去离子水，至观察到溶液的液面与刻度线相平时，停止加水，完成定容。而后，从稀释溶液中取一定量的溶液用zeta电位仪测量，对每组测定三次，然后将测定的关于这个单因素实验的结果进行记录，最终以平均值作为实验的测定结果。2.3.2反应温度在这个实验中，采用电子天平称取0.01g壳聚糖粉末，再用移液枪移取10ml亚硒酸钠溶液置于烧杯中，加入0.01g壳聚糖粉末，充分摇匀后，待亚硒酸钠与壳聚糖反应5min后，再分别加入40mlVc，反应2h，将溶液依次在分别在设定为为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的温度下进行加热，使用去离子水对于制取的纳米硒溶液进行100倍的稀释，在25ml的容量瓶里，加入250ul的纳米硒溶液，再加去离子水，至观察到溶液的液面与刻度线相平时，停止加水，完成定容。而后，从稀释溶液中取一定量的溶液用zeta电位仪测量，对每组测定三次，然后将测定的关于这个单因素实验的结果进行记录，最终以平均值作为实验的测定结果。2.3.3Vc质量在这个实验中，采用电子天平称取0.01g壳聚糖粉末，再用移液枪移取10ml亚硒酸钠溶液置于烧杯中，加入0.01g壳聚糖粉末，充分摇匀后，待亚硒酸钠与壳聚糖反应5min后，用分别加入20mL、40mL、60mL、80mL、100mLVc，反应2h，使用去离子水对于制取的纳米硒溶液进行100倍的稀释。在25ml的容量瓶里，加入250ul的纳米硒溶液，再加去离子水，至观察到溶液的液面与刻度线相平时，停止加水，完成定容。而后，从稀释溶液中取一定量的溶液用zeta电位仪测量，对每组测定三次，然后将测定的关于这个单因素实验的结果进行记录，最终以平均值作为实验的测定结果。2.3.4反应时间在这个实验中，采用电子天平称取0.01g壳聚糖粉末，再用移液枪移取10ml亚硒酸钠溶液置于烧杯中，再加入0.01g壳聚糖粉末，充分摇匀后，待亚硒酸钠与壳聚糖反应5min后，再分别加入40mlVc，取样时间段为溶液开始反应后的3h，每隔半小时用移液枪移取250ul的纳米硒溶液，置于25ml的容量瓶，使用去离子水对于制取的纳米硒溶液进行100倍的稀释，加去离子水，至观察到溶液的液面与刻度线相平时停止加水，完成定容。，而后，从稀释溶液中取一定量的溶液用zeta电位仪测量，对每组测定三次，然后将测定的关于这个单因素实验的结果进行记录，最终以平均值作为实验的测定结果。2.3.5亚硒酸钠质量在这个实验中，采用电子天平称取0.01g壳聚糖粉末，再用移液枪移分别移取1mL、5mL、20mL、40mL亚硒酸钠溶液置于烧杯中，加入0.01g壳聚糖粉末，充分摇匀后，待亚硒酸钠与壳聚糖反应5min后，用分别加入40mLVc，反应2h，使用去离子水对于制取的纳米硒溶液进行100倍的稀释。在25ml的容量瓶里，加入250ul的纳米硒溶液，再加去离子水，至观察到溶液的液面与刻度线相平时，停止加水，完成定容。而后，从稀释溶液中取一定量的溶液用zeta电位仪测量，然后将测定的关于这个单因素实验的结果进行记录，最终以平均值作为实验的测再定结果。2.3.6超声在这个实验中，采用电子天平称取0.01g壳聚糖粉末，再用移液枪移取10ml亚硒酸钠溶液置于烧杯中，再加入0.01g壳聚糖粉末，充分摇匀后，待亚硒酸钠与壳聚糖反应5min后，再分别加入10mlVc，分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的温度下超声10分钟，反应2h，使用去离子水对于制取的纳米硒溶液进行100倍的稀释。在25ml的容量瓶里，加入250ul的纳米硒溶液，再加去离子水，至观察到溶液的液面与刻度线相平时，停止加水，完成定容。而后，从稀释溶液中取一定量的溶液用zeta电位仪测量，对每组测定三次，然后将测定的关于这个单因素实验的结果进行记录，最终以平均值作为实验的测定结果。2.4优化实验建立在这些单因素实验的探索基础上，对单因素实验的结果进行分析，从而从中选择出对于纳米硒粒径影响较大的三个因素，运用DesignExpert软件中的Box-BehnkenDesign进行三因素三水平的响应面优化实验。根据响应面所设计的实验模型，进行ANOVA分析，通过对于F、P、Radj2、R2等参数的分析，评估该实验模型的可靠性，在实验模型可靠的前提下，对于模型获取的最优实验在进行实验的验证，从而对壳聚糖模板法优化制备纳米硒实验的最优实验进行确定。第三章实验数据分析与讨论3.1材料定性3.1.1壳聚糖模板法制备纳米硒电镜与能谱（a）电镜图（a）Electronmicrograph(b)能谱图(b)EnergySpectrum（c）元素扫描图（c）Elementscan图3-1纳米硒复合物电镜图Figure3-1Electronmicrographofnano-seleniumcomplex如电镜图3-1（a）中所示，所制备的壳聚糖纳米硒由两种物质构成，一种存在明显的空隙，有比较多的孔隙结构；一种较小，被空隙结构所包裹，由文献[4]可知，壳聚糖是大分子的结构物质，而纳米硒是纳米级的小物质，正是因为壳聚糖作为模板包裹住才可以制得稳定的纳米硒。结合能谱图3-1(b),可看到硒，以及壳聚糖组分的存在，图3-1(c)进一步显示硒存在于C、O、Na中。由此，可以确定硒的顺利合成以及壳聚糖作为模板可有效的将硒固定在其内部，实验结果如上图所显示，在图中可以很清晰的看到。3.1.2紫外全波长扫描图通过紫外分光全扫描得到壳聚糖模板法制得纳米硒紫外全波长扫描图（图3-3）。图3-3不同溶液的紫外吸收光谱Figure3-3UltravioletAbsorptionSpectraofdifferentsolutions注：a-Vc溶液，b-壳聚糖和Vc反应溶液，c-亚硒酸钠，壳聚糖和Vc反应溶液，d-亚硒酸钠和Vc反应溶液，e-壳聚糖溶液·通过观察溶液的紫外全波长扫描图（图3-3），可知壳聚糖溶液没有紫外特征吸收光谱，而Vc的紫外吸收光谱在253nm左右，而制取的纳米硒溶液在波长为265nm左右具有一个明显的波峰，该吸收波峰与查阅文献资料[29]与制得纳米硒的紫外全波长扫描图中的特征吸收峰基本对应一致。图3-4不同溶液的红外光谱图Figure3-4IrSpectraofdifferentsolutions注：a-壳聚糖溶液b-壳聚糖Vc混合溶液c-亚硒酸钠和壳聚糖混合溶液d-亚硒酸钠，壳聚糖和Vc反应溶液根据上图及实验所测数据显示，比较ad曲线，-NH和-NH3+的反伸缩振动峰存在蓝移现象，结果与查阅文献[15]基对比基本对应一致，由此可以说明，壳聚糖在对于纳米硒的稳定方面，壳聚糖有着较好的作用。由图c可以看出，-NH和-NH3+的反伸缩振动峰其存在蓝移现象，结果与查阅文献[15]对比基本对应一致，说明在没有抗坏血酸的作用下，拥有其他还原剂的空气再与亚硒酸钠接触，也能够产生单质硒，之后再与壳聚糖反应。3.2单因素实验数据分析与讨论3.2.1壳聚糖对纳米硒粒径的影响分析壳聚糖作为模板对硒的粒径及稳定性趋势如下图所示（图3-5）。图3-5壳聚糖对壳聚糖模板法制备纳米硒粒径的影响趋势图Figure3-5TheinfluenceofChitosanonthesizeofseleniumnanoparticlespreparedbyChitosantemplatemethod由实验结果分析及图3-5所呈现趋势可知，化学法制备纳米硒中，纳米硒的粒径随着壳聚糖的增大表现为先增大后递减趋势，在投加量＜0.1g时，当壳聚糖投加量不断增多，制备纳米硒的粒径也在不断增大，其原因可能是：一方面，壳聚糖作为模板，当其投加量过多则不易溶解，容易形成团聚现象，另一方面，制备获得的纳米硒本身不稳定，造成壳聚糖不能够对制备成的纳米硒起到良好的分散和稳定作用。随之，当投加量＜0.1g时即超过一定范围后，虽然呈减小趋势，但是制备获得的纳米硒呈粘稠状，不易保存，容易凝固，所以，壳聚糖0.002g到0.01g的范围内进行选择，可以制得较小粒径的纳米硒。3.2.2温度对纳米硒粒径的影响分析壳聚糖作为模板对硒的粒径及稳定性趋势如下图所示（图3-6）。图3-6温度对壳聚糖模板法制备纳米硒粒径的影响趋势图Figure3-6TrendChartoftheeffectoftemperatureonthesizeofseleniumnanoparticlespreparedbyChitosantemplatemethod由实验结果分析及图3-6所呈现的趋势可知，随着温度的升高，实验所制取纳米硒的粒径呈现出先增大后减小的趋势，在25℃是最低，在30℃时，纳米硒的粒径最大。随着温度增加，纳米硒粒径增大的主要原因是，一方面，温度升高会促进晶形硒的形成。另一方面，随着温度升高，溶液的粘度会呈减小趋势，减弱了作为模板的壳聚糖对纳米硒的包裹作用，因此增大纳米硒的粒径。当温度＞30℃，随着温度的增加，纳米硒的粒径呈递减的趋势，到45℃是略高于25℃制备的纳米硒，但是从能源消耗和存储期限的角度考虑25℃制备纳米硒，其加热能耗较少，而且制备获得的纳米硒稳定性较高。3.2.3亚硒酸钠对纳米硒粒径的影响分析壳聚糖作为模板对硒的粒径及稳定性趋势如下图所示（图3-7）图3-7亚硒酸钠对壳聚糖模板法制备纳米硒粒径的影响趋势图Figure3-7DISODIUMseleniteeffectonthesizeofseleniumnanoparticlespreparedbyChitosantemplatemethod根据实验获取数据和上图表明纳米硒的粒径的大小随着亚硒酸钠的增加而增加，在亚硒酸钠为5ml时有一个最大值，随后纳米硒的粒径大小随着亚硒酸钠量的增加呈递减趋势。亚硒酸钠，作为壳聚糖模板法制备纳米硒的硒源，当还原剂和模板壳聚糖的量一定时，投加亚硒酸钠的量过多，还原剂不能与其充分反应所导致。图中虽然20ml至40ml呈递减趋势，是因为产生胶体容易沉降，在测量过程中发生沉降作用，使得测得粒径数值变小。此外，当亚硒酸钠溶液体积为20ml,40ml时，制备产生的纳米硒不稳定，容易转化为其他形式的硒，其不拥有像纳米硒这样的高生物活性，影响制取硒的效用。由此我们可以得出，应在＜20ml的范围内选取亚硒酸钠投加量，有利于使得纳米硒粒径达到最小。3.2.4Vc对纳米硒粒径的影响分析壳聚糖作为模板对硒的粒径及稳定性趋势如下图所示（图3-8）。图3-8Vc对壳聚糖模板法制备纳米硒粒径的影响趋势图Figure3-8TrendChartoftheinfluenceofVConthesizeofseleniumnanoparticlespreparedbyChitosantemplatemethod如图3-8所示，随着Vc量的不断增加，制取的纳米硒的粒径有先减小后增大的趋势，在Vc等于60ml左右粒径达到最小。当硒源和壳聚糖模板比例一定，且Vc投加量保持在一个较小的区间时，因亚硒酸钠不能和Vc充分反应致使测得粒径过大，当Vc投加量增加到一定值时，在纳米硒制备的制备过程中，两者能够充分的接触反应，此时粒径达到较小值，而后随着投加量的继续增加，导致Vc过多，影响反应进行。3.2.5反应时间对纳米硒粒径的影响分析壳聚糖作为模板对硒的粒径及稳定性趋势如下图所示（图3-9）。图3-9反应时间对壳聚糖模板法制备纳米硒粒径的影响趋势图Figure3-9TrendChartoftheeffectofreactiontimeonthesizeofseleniumnanoparticlespreparedbyChitosantemplatemethod根据实验获取数据和图3-9表明，随着反应时间的增大，纳米硒粒径整体呈现波动状态，可能是因为在壳聚糖和亚硒酸钠溶液与刚加入的Vc反应时，还没达到稳定状态，导致测得数据有较大变化，随着反应时间的增大，制取的纳米硒逐步趋于稳定，渐渐减小。3.2.6超声对纳米硒粒径的影响分析在本实验中，针对不同配比的纳米硒，超声之后，虽然在一定程度上可以减小纳米硒的粒径，但是其溶液中的纳米硒容易转化为其他形式的硒，因此不对此因素进行深入讨论。3.4响应面法优化实验3.4.1优化实验变量在单因素实验时，对于实验的结果进行分析，相比于其他的三个因素，壳聚糖投加量、Vc投加量、温度对纳米硒粒径影响较大，所以，以壳聚糖投加量（A）、Vc投加量（B）、温度（C）这三个因素作为变量，纳米硒粒径作为因变量，运用在DesignExpert软件中的Box-BehnkenDesign进行三因素三水平的响应面优化实验。采取Box-BehnkenDesign优化实验结果中的回归方程及方差等，对温度、Vc、壳聚糖这三个因素对纳米硒粒径影响的显著性进行评价，再将这三个因素对壳聚糖模板法制备纳米硒的影响程度大小进行排序，然后再对这三个因素之间的产生的交互作用进行分析，检验本实验研究的科学合理性，并最终确定采用壳聚糖模板法对制备纳米硒方法优化的最佳条件，优化实验变量表见表3-1。表3-1优化实验变量表Table3-1Optimizedexperimentalvariabletable变量单位符号最低值最高值温度℃A2545VcmlB210壳聚糖质量mlC0.0020.53.4.2Box-BenhnkenDesign优化壳聚糖模板法制备纳米硒实验用Box-BenhnkenDesign进行响应面法优化的获得的壳聚糖模板法制备纳米硒实验结果如表3-3所示。由表3-2中数据分析，得到的回归方程如下列所示:(3-1)表3-2优化实验结果Table3-2Optimizingexperimentalresults实验编号ABC提取率/(mg/g)平均实测值预测值10.00223516615920.0523519219230.002103513512840.05103521321350.00262514815060.0562528227670.00264518518480.0564518517790.026225242244100.0261025248250110.026245167172120.0261045253258130.026635145139140.026635129139150.026635128139160.026635135139170.0266351431393.4.3实验模型的分析通过响应面软件设计的壳聚糖优化制备纳米硒实验的实验模型结果，进行关于ANOVA的分析，进而对于模型的显著性进行检测。由表3-3为实验数据所得到的回归模型方差，由上表数据可知，F=54.33，P值<0.0001，表明所建立的是一个十分显著的模型，证明在优化实验中，单因素对于制备的纳米硒粒径的影响很大[30]。失拟项为P=1.66，表明其不存在显著的影响，也说明了这个方程在拟合方面良好。在这个软件显示的模型中，确定系数值，表明98.59%的类似实验可以适合于实验的模型，校正确定系数，<0.2，证实本实验模型存在很高的可靠性[31]，因为各数据表明了该实验模型的科学可靠性，同时也对于各单因素的设定的合理性进行验证，最后是适用于要求的最佳的壳聚糖制备纳米硒条件响应面法的回归模型[32]。因而，可以应用该实验模型进行不同实验因素对纳米硒粒径的影响程度顺序以及不同实验因素之间的交互作用的评价，检验该实验的科学合理性，并最终确定优化实验中壳聚糖模板法制备纳米硒的最佳条件。表3-3实验模型的分析Table3-3Analysisofexperimentalmodel方差源平方和自由度均方和F值P值显著性Model3.81×10494.24×10454.33<0.0001极显著A-壳聚糖7.08×10317.08×10390.62<0.0001极显著B-Vc251250.320.5893C-温度2.11×10312.11×103270.0013极显著AB6.76×10216.76×1028.650.0217显著AC4.49×10314.49×10357.460.0001极显著BC1.6×10311.6×10320.480.0027极显著B24.98×10314.98×10363.74<0.0001极显著C21.41×10411.41×104180.81<0.0001极显著BC21.3×10311.3×10316.650.0047极显著残差5.46×102778失拟项3.02×10231001.660.3120不显著纯误差2.44×102461总和3.87×10416注：校正确定系数(RAdj2)=0.9677，确定系数(R2)=0.9859，(P<0.01)代表差异极显著，(P<0.05)代表差异显著；(P＞0.05)代表差异不显著。校正确定系数；图3-10壳聚糖和Vc对壳聚糖模板法制备纳米硒粒径影响Figure3-10EffectofChitosanandVConthesizeofseleniumnanoparticlespreparedbyChitosantemplatemethod图3-11壳聚糖和温度对壳聚糖模板法制备纳米硒粒径影响Figure3-11EffectofChitosanandtemperatureonthesizeofseleniumnanoparticlespreparedbyChitosantemplatemethod图3-12温度和Vc对壳聚糖模板法制备纳米硒粒径影响Figure3-12TEffectoftemperatureandVconthesizeofseleniumnanoparticlespreparedbyChitosantemplatemethod由图3-10可以看出，曲面较为平滑，壳聚糖与Vc的交互作用不显著[24]，随着Vc量的不断增加，温度对于壳聚糖制备纳米硒的粒径大小的影响越不显著，而由图3-11可以看出，壳聚糖与温度的确是存在一定的相互关系，随着壳聚糖量的增加，粒径呈递减规律，当温度呈45℃时，壳聚糖对于粒径的影响不显著。由图3-12可以看出，曲面较为陡峭，Vc与温度的影响较为显著，当Vc含量较高时，影响较为显著，当Vc含量保持较低水平时，显著性较不明显。结合图3-10和图3-11可知，当Vc对和温度的条件较优时，壳聚糖对壳聚糖模板法制备纳米硒的粒径随着壳聚糖量的增加呈逐渐减小趋势。结合图3-11和图3-12可知，当壳聚糖和Vc的条件较优时，温度对壳聚糖模板法制备纳米硒的粒径随着温度的增加呈先增大后减小的趋势。结合图3-10和图3-12可知，当壳聚糖和温度的条件较优时，Vc对壳聚糖模板法制备纳米硒的粒径随着Vc呈逐渐减小趋势[32]。3.4.4Box-BenhnkenDesign响应面法优化结果壳聚糖投加量（A）、Vc投加量（B）、温度（C）是这个优化实验选择的三个因素，在对这个3因素3水平的Box-BenhnkenDesign响应面分析实验分析时，由表3-7中的回归系数检验值F可知，3个因素对壳聚糖模板法优化制备纳米硒的实验的影响程度从大到小依次为壳聚糖(A)，温度(C)，Vc投加量(B)。采用Box-BenhnkenDesign响应面法优化后，得到的壳聚糖模板法优化制备纳米硒的实验的最佳条件为：壳聚糖为0.006g,温度为35oC，Vc投加量与亚硒酸钠投加量比例为5:1。在此最佳条件下，本实验所能制备的最优纳米硒粒径为116nm。3.4.5验证Box-BenhnkenDesign响应面法优化结果通过DesignExpert软件进行Box-BenhnkenDesign响应面法优化对壳聚糖模板法优化制备纳米硒的实验，得到本实验最佳条件为：壳聚糖为0.006g,Vc投加量与亚硒酸钠投加量为5:1，温度为35oC。本实验在此最佳条件下制备的纳米硒粒径为116nm。实验结果如表3-4所示。表3-4优化实验结果验证Table3-4Validationofoptimizedexperimentalresults批次粒径大小(nm)相对误差(%)11280.1121560.3431550.34根据实验及表3-4结果表明，在Box-BenhnkenDesign响应面法优化后得到的最佳实验条件进行验证实验，得到的实际纳米硒粒径分别为128nm、156nm、155nm，平均值为146nm，与116nm的理论值接近，测定结果较为稳定，偏差不大，证明该方程在与实际实验情况拟合方面较为良好，验证对于壳聚糖模板法制备纳米硒的实验进行回归分析和参数优化是有效的，有一定的使用价值。第四章结论与展望4.1结论在这次的纳米硒研究中，采用壳聚糖模板法优化制备纳米级硒的方法，主要指标为合成硒的粒径，由zeta电位仪进行测定该指标，在定性实验和单因素实验结果分析的基础上，采用响应面法，使用Box-BenhnkenDesign软件进行优化参数的步骤。实验通过对于壳聚糖模板法优化制备纳米硒制取的材料中从紫外光谱，红外，电镜能谱这些方面进行了定性分析，在紫外光谱中，对应纳米硒波长为265nm,在红外光谱中，-NH和-NH3+的反伸缩振动峰出现蓝移现象，在电镜和能谱中，可以得出所制备的物质有壳聚糖这个大分子的结构物质和纳米硒这个纳米级的物质，均与文献基本对应一致。在此基础上，再分别探究纳米硒粒径与亚硒酸钠，Vc投加量，温度，壳聚糖，反应时间的单因素变量实验，分析得出实验结果，从而选择出对纳米硒粒径影响较大的三个因素，壳聚糖，Vc投加量，温度，在此基础上，以壳聚糖，Vc投加量，温度为优化实验中的变量，通过Box-BenhnkenDesign进行三因素三水平的响应面实验，进一步优化化学法制备纳米硒的条件，根据实验结果，对其回归系数检验值F进行分析比较，得出3个因素对纳米硒粒径大小的影响程度由大到小，依次为壳聚糖，温度，Vc投加量，温度，在最后使用平行重复试实验证壳聚糖模板法制备纳米硒的最优条件。其最优条件为，壳聚糖0.006g，Vc投加量为5ml,即亚硒酸钠投加量与Vc投加量为1:5时，温度为35℃，制备粒径为116nm.4.2展望我国的硒资源存在分布不均的特点，富硒土壤主要集中于西部地区，硒作为一种必不可少的元素，虽然目前已开发许多富硒产品，但是依旧满足庞大的市场要求，加上一些天然产品富硒含量的不确定，因此，对于硒的人工制备的前景十分广阔。对于纳米硒制备的方法研究更是十分有必要研究的领域。用壳聚糖模板法制备纳米硒研究中，在原料上，作为多糖的一种的壳聚糖，一方面，具有价格实惠，来源广的优点。另一方面，在化学性质上存在生物降解性高等诸多优势，有利于纳米级粒子跟细胞膜的结合，能够很好的起到对吸收的推进作用。同时，研究所采取的的方法条件简单，能耗低，能够制备出具有生物学效用的纳米硒。运用Box-BehnkenDesign响应面法进行壳聚糖模板法制备纳米硒的实验优化，可以为后续纳米硒的制备工艺进一步开发利用研究提供科学可靠的数据，希望可以助推我国富硒农业的发展，进一步推动我国现代化农业进程提供有效的助力。参考文献［1］

李根林，高红梅

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喷施亚硒酸钠对小麦产量的影响

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