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37CodeofpracticeformonitoringmitochondrialDNAgeneticdiversityofmarineI 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 6 6 6 8 9 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定1海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测技术规程本文件确立了海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序，规定了监测方案设计、样品采集、保GB/T12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异4监测程序海洋动物资源线粒体DNA遗传多样性监测程序包括监测方案设计、样品采集、保存与运输、样品检2制、数据分析、监测报告等。其中，对调查海域某种野生海洋动物资源的遗传多样性监测，宜每5年~a)现场调查采样：按GB/T12763.6规定执行。对海洋底移动迅速的底栖动物可设地笼诱捕。对游泳能力强的鱼类、甲壳类等进行拖网采c)对海洋保护动物、珍稀濒危生物实行非致死性采样：3●视监测生物的具体情况，无菌操作剪取部分鱼类鳍条组织约0.1g，或用无菌静脉处抽取血液约0.5mL；采集的每批样品分别填写样品采集记录，格式参见附细胞色素氧化酶I（Cytochromeo录B。酚-氯仿法提取DNA的步骤参见附录C；用商品化试剂提取的DNA用洗脱液或灭菌双蒸水溶解，取5μL经1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA质量，电泳方法参见附录D，或取适量DNA溶液用核酸定量分析仪测定，A260/A280比值为1.8～2.0，DNA浓度不低于50ng/引物宜引用已公开发表学术论文或研究报告，或在基因数据库中搜索目标物行设计2对～3对，引物宜符合Tm值50℃~60℃、长度18bp～24bp、G+C含量在40%～60%、PCR产物长度4用合成的引物对样品进行预实验。按每对引物的Tm值设定退火温度，按7.5.2进行PCR。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，选择PCR产物条带单一、清晰、且长度与预期一致的引物，作为），对所有样品进行扩增后，PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，选择单一、清晰、且长度与预期一致9数据分析数与序列长度的比值）等遗传多样性数据。分析结果格式参见5o现场调查采样：□定点；□地笼；□拖网□整体；□肌肉；□血液；□鳍条；□其他：□鲜活；□新鲜；□变质□活体；□冷冻；□冰鲜；□常温；□其他：6h)核酸定量分析仪；7C.10离心管开口放于洁净的环境中，自然干燥15min～30min。8950ng～100ngMgCl2检测记录海洋动
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