生物化学 DNA的复制修复和重组 1

DNA的复制，修复和重组

DNA

Replication，Repair，and

Recombination1上节课内容：核酸的分解过程：核酸→核苷酸→核苷+磷酸→嘌呤碱和嘧啶碱+戊糖-1-磷酸核苷酸酶：水解核苷酸生成核苷和磷酸

核苷磷酸化酶将核苷和磷酸转化成游离碱基和戊糖-1-磷酸，反应是可逆的嘌呤分解：尿酸

腺嘌呤转化成次黄嘌呤，鸟嘌呤转化为黄嘌呤脱氨反应也可在核苷或核苷酸水平上发生嘌呤的分解主要在肝脏、小肠及肾脏中正常人血浆中尿酸的含量为20～60mg/L，超过80mg/L时，尿酸盐晶体沉积于关节、软组织、软骨及肾而导致关节炎、尿路结石和肾病，称痛风症

别嘌呤醇，与次黄嘌呤结构非常类似，在细胞内被转换为别黄嘌呤，是黄嘌呤脱氢酶的一个很强的抑制剂，可防止非正常的高水平的尿酸的形成

嘧啶分解：产物易溶于水

β-丙氨酸或β-氨基异丁酸

嘧啶的降解主要在肝脏进行胞嘧啶→尿嘧啶→二氢尿嘧啶→β-脲基丙酸→β-丙氨酸→乙酰CoA→TCA胸腺嘧啶→二氢胸腺嘧啶→β-脲基异丁酸→β-氨基异丁酸→琥珀酰CoA→TCA

2核苷酸合成的基本途径1.有从头合成和补救合成两条基本途径。2.肝组织主要进行从头合成，而脑、骨髓、红细胞等只能进行补救合成。新生及年轻组织的内源性核苷酸从头合成比例大；而衰老组织及肝功能降低时，补救合成比例增大。

核苷酸的合成

3新陈代谢，中间代谢，物质代谢，能量代谢，食物的卡价，呼吸商，基础代谢体内的代谢调节在三种不同水平上进行：(1)细胞或酶水平调节

(2)激素调节

(3)神经调节其中酶的调节是最基本的调节方式，是一切调节的基础。酶的调节是通过控制酶的活性和酶的合成量代谢抑制剂抗代谢物目录Section1.

引言Section2.本章背景Section3.基于DNA的DNA复制Section

4.

DNA的损伤及修复Section

5.

基于RNA的DNA的复制Section

6.

DNA的重组45Section1.

ç（Introduction）现代生物学的三大基石：1838-1839年细胞学说1859年达尔文进化论1866年孟德尔遗传学达尔文孟德尔施旺施莱登6生物化学的三大阶段：1890-1930年生命的分子基础1930-1950年生物的氧化和代谢1950年-

生命的遗传信息流动分子生物学（Molecular

Biology）生物化学（Biochemistry）遗传学（Genetics）7分子生物学三大基石及简史：1941年比德尔和塔特姆提出了“一个基因，一个酶”学说。基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。1953年沃森和克里克提出了DNA的反向平行双螺旋结构。提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。1961年雅各布和莫诺提出了操纵子的概念。解释了原核基因表达的调控。比德尔塔特姆沃森克里克雅各布莫诺8核心：中心法则（Central

Dogma）91869年Miescher发现了核酸及核酸的主要成分是DNA。Miescher101928年FrederickGriffith肺炎球菌转化试验。证明有转化因子的存在。FrederickGriffith

111944年Oswald

Avery体外肺炎双球菌转化，噬菌体侵染试验。证实了遗传物质是DNA而不是蛋白质。121941年比德尔同塔特姆合作链孢菌实验。比德尔和塔特姆认为：所有生物体内的一切生物化学过程最终都由基因控制;这些过程都可细分为一系列化学反应;各个反应均以某种方式受单个基因的控制;单个基因的突变只能改变细胞进行某一化学反应的能力。比德尔塔特姆131951年X~rayphotographofDNAwithhighqualityM.H.F.Wilkins141951年

JamesWatson和FrancisCrick提出DNA双螺旋结构。151958，MatthewMeselsonandFranklinStahl证明在细菌中DNA的复制是半保留复制。161961年FrancoisJacob和SydneyBrenner发现核糖体是翻译必须的。不同的mRNA在核糖体作用下会生成不同的蛋白。171960s

MarshallNirenberg；GobindKhorana；RobertW.Holley对遗传密码子及蛋白合成的功能进行了研究。MarshallNirenbergGobindKhoranaRobertW.Holley181970.

HowardTemin；DavidBaltimore发现了逆转录HowardTeminDavidBaltimore191983.BarbaraMcClintock在1948年的转座现象被授予诺贝尔奖

DNAtransposableelementBarbaraMcClintock

20TheNobelPrizeinChemistry1989：Altman和Cech的核酶的发现（1981）"fortheirdiscoveryofcatalyticpropertiesofRNARibozyme"SidneyAltman

ThomasR.Cech21TheNobelPrizeinChemistry1993Mullis的聚合酶链式反应扩增DNAKaryB.Mullis

"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"221997，TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine朊蛋白的发现

"forhisdiscoveryofPrions–anewbiologicalprincipleofinfection"StanleyB.Prusiner23Section2.

本章背景DNA单链的结构24DNA双螺旋结构DNA双螺旋化学结构25Watson-Crickmodel：26为什么会想到Purine和Pyrimidine的配对？RosalindFranklin的结晶数据，3.4nm的距离如何解释Chargaff’s规则27Section3.

基于DNA的DNA复制28DNA复制的一般特征：半保留复制以原先DNA作为模版，需要4种dNTP，Mg2+作为模板的DNA需要解旋需要引物复制方向始终是5’-3’具有固定的复制起点多数为双向复制，少数为单向半不连续性高度的忠实性29DNA的复制方式：全保留复制Conservativemodel半保留复制Semiconservativemodel弥散复制Dispersivemodel30半保留复制证明实验1958

Meselson和Stanl实验----原核生物Taylor植物根尖细胞染色体放射性实验----真核生物3132DNA复制的起始：DNA的类型线性超螺旋环状超螺旋环状负超螺旋33原核生物的DNA复制环状DNA一个复制起始位点34真核生物的DNA复制线状DNA多个复制起始位点35拓扑异构酶Topoisomerase复制起始位点（Ori）Originsofreplication复制叉Replicationfork解旋酶Helicases单链结合蛋白（SSB）Single-strandbindingproteins引物

Primer引发酶Primase36DNA聚合酶DNApolymerase

模板链

Template

strand37先导链

Leading

strand

后随链

Lagging

strand5’3’3’5’38395’3’3’5’冈崎片段

Okazakifragment

4041DNA聚合酶IIIDNApolymerase

IIIDNA聚合酶IDNApolymerase

IDNA连接酶DNAligase

42问题：为什么是5’-3’方向合成？为什么要用RNA作为起始模板？如何保证复制的忠实性？

43拓扑异构酶

Topoisomerase拓扑异构酶I自然状态下DNA为负超螺旋拓扑异构酶I用来移除负超螺旋（热力学过程）拓扑异构酶II用来增加负超螺旋（消耗ATP）过程都是a.剪断DNA链b.重新缠绕c.封口不同：I.不需ATP，剪断单链II.需要ATP，剪断双链相同：活性中心为Tyr44拓扑异构酶I作用机理4546细菌的拓扑异构酶II作为抗生素的靶点人拓扑异构酶I作为抗肿瘤药物的靶点Camptothecin47DNA解旋酶

DNA

HelicasesDNA解旋酶需要ATP

48DNA聚合酶

DNApolymerase

ReplicationComparison

Procaryotic Eucaryoticspeed 1000b/sec 50b/secOkazaki 1000b 100-200b primer ~30b ~3-5borisites single multiplePol nuclease nonuclease49DNAPolymeraseIDNAPolIwasthefirstpolymeraseisolated.ThiswasobtainedfromE.colibyArthurKornbergandisknownastheKornbergenzyme.Thisenzymehasa5'-3'exonucleaseactivitythatcleavesRNAprimers,a5'-3'polymeraseactivitythatmakesDNAanda3'-5'exonucleaseactivitythatrepairsDNA.TheKlenowfragmentisthelargeportionaftercleavingoffthe5'-3'exonucleaseandhasbeenusedasapolymeraseinlabwork.50Klenow片段Klenowfragment又名DNA聚合酶I大片段汉斯·克列诺于1970年用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ时，得到的两个片段中分子量较大的一个。C末端605个氨基酸残基片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。用于cDNA第二链合成，双链DNA3ˊ-末端的标记粘性末端的单链补齐成为平头51DNAPolymerase

Activity

两个镁离子绑定在活性中心52分子形状vs氢键BothofthesedirectthymineintoaDNAstrandeventhoughtheonecannotformH-bonds.53构象的变化WhenthecorrectdNTPbindsachangeoccursresultinginatightfitfortheproperdNTPshape.5455ProteinsInvolvedinDNAReplicationinE.coli56复制起始位点（Ori）

Originsofreplication大肠杆菌的复制起始点命名为OriC245bp的高度保守序列在5’端有3个富含AT的序列（2个氢键1bp）在右边有5个9bp的序列，用来绑定DnaA（起始因子）57例子：大肠杆菌的DNA复制DnaA消耗ATP绑定在9bp的序列，诱导打开AT富集区域HU蛋白（组蛋白类似物）防止DnaA绑定OriC以外的序列当loop被DnaB（解旋酶）打开，在DnaT辅助下在复制叉处形成DnaB6•DnaC6•ATP6DnaB继续解旋，增大解旋的空间，SSB结合到ssDNA上防止退火（Annealing）拓扑异构酶II在复制叉的上方作用，用来减轻下方DnaB解旋的压力PrimingEventsPriA,PriBandPriCenterthebubblealongwithDnaG(DNAprimase).ThiscompletestheprimosomewhichmakesRNAprimers.TopoIIandSSBarenotpartoftheprimosome.DNAprimasedoesnotneedaprimertobeginsynthesisofRNAprimers.Theprimers(10-30bp)beginatthecenterbaseofanyGTTsequenceandstartaprimeraboutevery1000bp.Onlyoneprimerisneededontheleadingstrand.Afterthisismade,theprimosomemovestothelaggingstrand.58ReplicationEventsTwoPolIIIholoenzymes(DnaE)enterwithafewotherproteinstocompletethereplisome.PolIIIisanasymmetricdimerthatsynthesizesDNAfrombothtemplatestrandssimultaneously.PolIIIneedsaprimertobeginsynthesis.Theleadingstrandissynthesizedcontinuouslyandthelaggingstranddiscontinously.Botharesynthesizedinthe5'-3'direction.Bidirectionalsynthesisoccursatbothreplicationforks.59DNAPolIII,theReplicasePolIIIformsaslidingclamparounddsDNA.Thisenzymeistheworkhorseofreplicationandisveryprocessive.60PrimingDNASynthesisAprimerisrequiretostartDNAsynthesis.61LeadingandLaggingStrandSynthesisOkazakifragmentsaremadeonthelaggingstrand.62LayoutofParticipantsGeneralarrangementofreplicationparticipants.6364SynthesisonbothStrandsPOLIIIformsaslidingclamparounddsDNA.Thisenzymeisveryprocessive.65LaggingStrandSynthesisThelaggingstrandloopstoenablebothPolIIIcoreunitstomoveinthedirectionofthereplicationfork.ThelaggingstrandbeginsreplicationataprimerandproceedsuntilitrunsintoanotherOkazakifragment.Atthispointthecoreunitdissociates,thechainshiftstopositionanotherprimer,thecorerebindsandmakesanotherOkazakipiece.Thelaggingstrandwillalwaysbealittlebehindtheleadingstrand.66JoiningOkazakiFragmentsJoiningthesefragmentsrequiresDNAligaseafternicktranslationhasoccured.67StepsforJoiningOkazakiFragmentsDNAligasesealsthenicksusingNAD+forenergyafterPolIhasremovedRNA.SomeorganismsuseATPtoadenylatetheligase.E-lys+NAD+-->AMP-NHlys-E+NMP5'-p-DNA+AMP-NHlys-E-->AMP-5'P-DNA+E-lysAMP-5'P-DNA+3'OH-DNA-->DNA(sealed)+AMP68E.coliTerminationTheE.coli''terregion''isa~350kbpsequence180ofromOriC.Itcontainssevensequences,TerAtoTerG,whicharebindingsitesfor''tus'',terminatorutilizationsubstance.TheTersequencesare~20bplongandcontaintheconservedsequence5'-GTGTGTTGT-3'.Whentusisboundreplicationstopsbyblockingthehelicase.G F B C A D E 5'-----À------À-----------À-------À-------™------™------™-------3'

6970PositionsoforiCandter

inE.coliE.coliTerminationTheclockwisereplicationisstoppedatterB,C,ForGandcounterclockwisereplicationatterA,DorE.Theprocessiscompletewhensynthesisfromtheoppositedirectionreachesthestoppedstrand.Atthispoint,thetwonewDNAsareintertwinedandTopoIImediatesunravelingthesebycleavageandreassembly.7172线性末端DNA复制碰到的问题真核细胞染色体末端端粒端粒真核细胞的染色体线性末端序列用来稳定染色体。在人体内是重复序列AGGGTT。通过端粒酶在染色体末端逐渐加上。端粒酶是一种逆转录酶。端粒酶含有RNA的模板。73端粒的合成Telomere

SynthesisTelomerasehasanRNAtemplate.74端粒的合成Telomere

Synthesis7576DNA复制的高度忠实性也叫高保真度（High-Fidelity）Fidelity=1:109四种dNTP的平衡（体内核酸代谢的调节）DNA聚合酶的高度选择性（Proofreading）DNA聚合酶的自我校对功能（Exonuclease）错配修复（下一节内容）使用RNA作为引物只能从5’到3’77Section4.

DNA的损伤及修复DNA的损伤的原因细胞内因素DNA复制的错误DNA自身结构不稳定活性氧ROS环境因素紫外辐射离子辐射化学诱变剂（黄曲霉素，顺铂，烷基化试剂，化学武器）78DNA损伤的类型碱基的损伤及DNA链的损伤碱基的丢失或脱落碱基的转换碱基的修饰碱基的交联DNA链的断裂DNA链间交联DNA链与蛋白交联7