（高清版）DB37∕T 3126-2018 禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范　　

DB37DB37/T3126—2018禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范TechnicalGuidelineofImmunofluorescentTestofBordet2018-022018-02-2018-03-山东省质量技术监督局发布IDB37/T3126—2018本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准由山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心负责起草。本标准主要起草人：朱瑞良、胡莉萍、魏凯、黄河、杨萍萍、孙振红、彭军、张华杰、万吉国。1DB37/T3126—2018禽波氏杆菌免疫荧光检测技术规范本规范规定了禽波氏杆菌病间接免疫荧光检测技术的试剂或材料、仪器设备、禽波氏杆菌外膜蛋白 (OMP)的提取、禽波氏杆菌OMP含量测定、禽波氏杆菌外膜蛋白(OMP)抗血清的制备、阴性血清制备、禽波氏杆菌免疫荧光检测方法和判定标准。本规范适用于山东省境内从事家禽饲养以及从事家禽防疫活动的单位和个人禽波氏杆菌检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB14925实验动物环境及设施3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。蛋白定量Bradford法Bradfordmethodforpro考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应灵敏，可测定微克级蛋白质含量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS,即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小 (可以忽略电荷因素),可以用于分离蛋白质和寡核苷酸。免疫荧光试验immunofluorescencetest2DB37/T3126—2018先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。4.2抗体异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG。4.3生化试剂邻苯二胺(OPD)、聚乙二醇辛基苯基醚(Tri-tonX-100)、考马斯亮兰G-250、牛血清白蛋白(BSA)、不完全弗氏佐剂、丙酮(分析纯)、乙醇(分析纯)、甘油(分析纯)。5.2恒温培养箱。5.3超速冷冻离心机。5.4蛋白电泳仪。5.7超声波破碎仪。5.8旋涡混合器。5.9分光光度计(380nm～780nm)。6.1将保存的禽波氏杆菌株接种于200mL肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜后，离心收集过夜培养的细菌。肉汤培养基配制按附录A执行。6.2用10倍体积的含有10mMMgCl₂的Tris-HCl(100mMpH7.8)缓冲液悬浮，超声波破碎(功率为500W、破碎时间60s、间隙60s、反复破碎10次)。Tris-HC1缓冲液配制按附录A执行。6.4含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含2%TritonX-100的Tris-MgCl₂缓冲液溶解，室温下孵育30min降解内膜蛋白后，再进行100000×g,30min超速离心。6.5沉淀用缓冲液再悬浮，置-20℃保存备用。7禽波氏杆菌0MP含量测定3DB37/T3126—20187.1考马斯亮蓝法7.1.1取16支试管，1支作空白对照，3支用于检测禽波氏杆菌OMP样品，其余12支试管分为两组，每组6支，用于绘制标准曲线。7.1.2用移液器向每组6支试管中各加入1.0mg/mL的标准蛋白质溶液各0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL,然后用去离子水补充到0.1mL。7.1.3各试管中分别加入5.0mL考马斯亮兰G-250试剂，立即在旋涡震荡器上混匀；空白对照管为0.1mL水与5.0mL考马斯亮兰G-250试剂的混合液。7.1.4加完试剂2min~5min后，用塑料或玻璃比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸7.1.5用标准蛋白质量(mg)为横坐标，吸光度值ODsg₅为纵坐标，绘制标准曲线。根据检测样品的0Ds957.2考马斯亮蓝微量法7.2.1样品中蛋白质浓度较稀时(10mg/mL～100mg/mL)采用微量法检测。7.2.2每支试管的蛋白溶液量加大到1.0mL,加考马斯亮蓝G-250试剂5.0mL,根据测定的ODs₉5值绘制标准曲线，计算样品中禽波氏杆菌OMP的含量。7.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳7.3.1分别配制SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，安装垂直电泳装置。分离胶和浓缩胶配制按附录A7.3.2用移液器将OMP样品加至加样孔，进行电泳。7.3.3电泳结束，用考马斯亮蓝R250对蛋白胶进行染色，检验禽波氏杆菌OMP的提取效果。8禽波氏杆菌外膜蛋白(OMP)抗血清的制备8.1将提取的禽波氏杆菌OMP蛋白液与弗氏不完全佐剂混合(V:V=1:1),用漩涡振荡器乳化，制备禽8.2选取体重2.5kg的健康青紫兰家兔4只，颈背部皮下注射免疫OMP抗原，共免疫4次，每次间隔8.3最后1次免疫后7d采血，检测兔血清中禽波氏杆菌抗体的凝集价，凝集价高于1:256以上时采血，分离血清，-20℃保存备用。9阴性血清制备采集未免疫的健康青紫兰兔血液，制备阴性血清。10禽波氏杆菌免疫荧光检测方法10.1被检禽波氏杆菌涂片的制备10.1.1组织涂片的制备4DB37/T3126—2018取临床疑似禽波氏杆菌病的鸡肝脏组织进行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15min10.2.1向涂片中滴加1:10倍稀释的禽波氏杆菌OMP抗血清100μL,置于37℃湿盒中孵育30min,用PBS洗涤3次。10.2.2加1:100倍稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG二抗，置于37℃湿盒中孵育30min,用PBS洗涤3次。10.2.3用吸水纸吸干后滴加甘油，将涂片置于荧光显微镜下观察。阳性对照呈现明显的黄绿色荧光，阴性对照无黄绿色荧光，则检测结果有效。荧光显微镜中出现黄绿色荧光，判为阳性，用“+”表示；未出现黄绿色荧光，判为阴性，用“-”5DB37/T3126—2018AA(资料性附录)溶液的配制成分配制不同体积SDS浓缩胶所需各成分的体积(mL)5%浓缩胶23468水4.130%Acr-Bis(29:1)0.330.671MTris(pH6.8)0.250.380.750.020.030.040.060.0810%过硫酸铵0.020.030.040.060.08TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积(mL)12%分离胶5水4.030%Acr-Bis(29:1)4.020.01.5MTris(pH8.8)0.050.1510%过硫酸铵0.050.15TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02氯化钾磷酸二氢钾双蒸水定容至1000mL6DB37/T3126—20A.2.2普通肉汤培养基的配方蛋白胨10g牛肉膏粉3g氯化钠5g最终pH7.4±0.2A.2.31mol/LTris-Hcl缓冲液(pH7.8)的配制浓盐酸(1mol/LHCl)双蒸水42.0mL定容至1000mL在900mL双蒸水中加入121.1gTris碱，溶