小麦快速发育、分子标记辅助育种技术规程

小麦快速发育、分子标记辅助育种技术规程分子标记（辅助目标基因的转育与聚合）、田间辅助选育等技术要求。本文件适用于快速创制小麦种质及培育小麦新品种。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性应用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4404.1-2008粮食作物种子第1部分：禾谷类GB/T40188-2021畜禽分子标记辅助育种技术规程DB2017/0005-2022温室玉米加代育种生产操作规程DB21/T2339-2014百合鳞片组织培养扩繁技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。小麦快速发育（RapidWheatdevelopment）利用人工气候室，依据小麦生长发育特点，去除小麦籽粒灌浆与后熟的发育阶段，加速营养生长阶段，从而缩短小麦生长发育周期。4前期准备4.1仪器4.1.1DNA提取仪器核酸提取磨样机、水浴锅、移液器（1ML、100ul、10ul）、涡旋仪、低温高速离心机（最高转速>10000rpm）和通风橱等。4.1.2PCR检测仪器PCR仪、电泳槽及凝胶成像系统。4.2小麦种植所需设施、生产资料4.2.1主要设施设备光温可控温室：可控温度15℃~35℃;光通量密度.>100μmol/m2·s，采光或光照时间>14h。人工气候箱：可控温度6℃~25℃,光通量密度.>100μmol/m2·s。栽培盆规格：直径25cm*高21cm育种田：土壤类型为粘土具有良好的肥力，pH值适中（通常在6.0-7.5之间排水良好，无盐碱化现象；隔离条件，为了防止不同品种之间的交叉污染，育种田应与其他小麦田保持一定的隔离距离，通常建议至少100米以上。4.2.2生产资料育苗基质、穴盘、穴盘托等、磷酸二氢钾等常用肥料，百菌清、吡虫啉、菊酯类等常用抑菌防虫药物。5方案确定5.1分子标记的筛选及亲本的确定根据育种目标，利用公共数据库（如：）或文献获得目标基因标记信息及供体亲本，并对这些标记的可靠性进行验证。5.2亲本的选择受体亲本选择：当地自然和栽培条件的推广品种，系谱及遗传背景明确，综合农艺性状表现好，且具有较好的配合力，只有少数需改良性状缺陷（质量或主效基因控制的性状）。供体亲本选择：系谱及遗传背景明确，综合农艺性状表现好，含有与受体亲本互补性状的质量或主效基因。5.3育种途径的确定5.3.1转育单个基因转育单个基因，室内单交(A/B)再连续回交3-4次(BCn)，然后自交2次，BCnF3代以后分子标记辅助田间选择。5.3.2多个基因聚合2个基因聚合亲本各含一个目标基因，室内单交(A/B)后自交2次，F3代以后分子标记辅助田间选择。3个基因聚合每个亲本各含一个目标基因，采用复交的方式。一个亲本分别与另外两亲本杂交，杂交后代再杂交(A/B//A/C)，然后自交2次，F3代以后分子标记辅助田间选择。6快速发育（幼胚培养）6.1幼穗的选取取授粉后15d左右的小麦幼穗，选取麦穗中部的6个小穗，去除包被的颖壳备用。6.2幼粒的消毒在超净工作台中，用1.5%的次氯酸钠进行表面消毒10～15min，再用灭菌ddH2O冲洗6.3幼胚的获取用镊子捏住胚乳以固定籽粒，在籽粒顶部找到胚的位置，用另外一只镊子在胚的左右两端稍用力挤压，从而获得完整的幼胚（15d左右的小麦胚为淡黄色）。取胚的过程在无菌超净工作台中进行。6.4胚苗的培养将剥离的完整胚，盾片向下接种于PM培养基（附录A）中，每个三角瓶（30ml的PM培养基）接种7～10个幼胚。接种好的幼胚在25°C、16h/d光照培养箱中培养3d。6.5幼苗的春化将培养3d的胚苗放入6～8°C、16h/d光照培养箱中，春化30d。6.6温室内小麦栽培管理6.6.1供试土壤取田间中等肥力土与蛭石1:1比例，施入底肥，混拌均匀备用。田间土壤要求：土壤质地为壤土或轻壤土，有机质含量在1.5%～2.5%之间；土壤pH值在6.0～7.5之间；全氮含量在0.1%～0.2%之间；有效磷含量一般要求在15～30mg/kg之间；速效钾含量在100～150mg/kg之间。6.6.2施肥管理施肥处理N、P2O5、K2O用量分别为0.3g/kg、0.2g/kg和0.13g/kg；磷肥、钾肥和60%的氮肥在拌土时施入，40%的氮肥作为追肥。6.6.3小麦室内管理采用栽培盆种植，每盆装供试土壤10kg，每盆定苗8株，于20°C～25°C、16h/d光照栽培，在小麦苗期及拔节期温度控制在15°C～22°C之间，孕穗期及以后温度控制在20~30°C之间，土壤含水量控制在60%-80%之间。7分子标记辅助育种（转育与聚合）7.1调节亲本花期相遇父本分三批次种植于温室，每批次种植间隔5d；母本与第二批次父本同时种植。7.2DNA的提取目标基因转育和聚合过程中，对杂交后代通过春化的幼苗按单株编号，移栽前取部分叶片，采用常规的SDS方法或商业试剂盒提取DNA。7.3分子标记检测依据公共数据库（如：）或文献获得的目标标记信息，设计引物及确定反应条件，记录检测数据。7.4选择目标基因纯合的个体根据检测数据进行分析，保留含有目标基因的幼苗进入下一轮杂交或回交，直到聚合到全部的目标基因，自交2代获得目标基因纯合的个体，期间通过分子标记检测淘汰不含目标基因的单株。8分子标记田间辅助选育F3/BCnF3及以后世代在田间选择，主要通过分子检测与田间农艺性状表现相结合选优淘劣，在田间选择上，更侧重于农艺性状的综合表现。8.1单株选择F3/BCnF3～F4/BCnF4点播，选择株高、生育期、成穗数、结实性等农艺性好的优良植株，按单株收获，再通过比较种子大小、饱满度等进一步选优淘劣。8.2株行比较F5/BC3F5代种植成株行，每单株种3行，冬前按行内混合取样，提取DNA进行目标基因检测。田间调查时及在收获前后根据快速育种目标选优淘劣。8.3产量比较试验及技术成果的应用筛选出的综合农艺性状优良的品系，进行两个年度的产量比较试验，产量等综合农艺性状好品系，根据其品系特点可参加国家及省不同组别的相关小麦审定试验；对于聚合多个优异基因，但农艺性状稍差的品系作为育种中间材料进行保存。（资料性）A.1符号、代号、缩略语本文件所涉及的主要符号、代号、缩略语的全称及中文释义如下：ddH2Odoubledistilledwater双蒸水MASMark-assitedselection分子标记辅助选择SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠A.2PM培养基制作A.2.1实验室常用仪器、器具培养箱、高温高压灭菌锅、移液器、称量天平、冰箱(4℃,-20℃,-80℃)、pH测量仪、镊子、组培瓶、酒精灯，以及PM培养基、蒸馏水、琼脂粉等。A.2.2PM培养基配方NH4NOKHPOHBOCHNOCHCNSCHNOCHNOFeSOOCHONOCHOA.2.3制作步骤①配制溶液向容器内加入所需蒸馏水的一部分，按照配方称取各种药品，并依次加入（前面的药品充分溶解后再添加后面的药品最后补足所需水分。对难溶的物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部