ALK阳性NSCLC诊断方法更新

NSCLC分子病理诊断的重要性NSCLC：肿瘤驱动基因及相应靶向药物驱动基因检测：靶向药物选择和临床试验规范分子检测：是规范治疗的前提和保证EGFRKRASALKfusions3-7%HER2BRAFPIK3CAAKT1MAP2K1NRASROS1fusionsKIF5B-RET上海肿瘤医院胸外科-非吸烟腺癌广州省人民医院中国ALK阳性NSCLC总患者数约为HER2阳性乳腺癌患者的70%，CML患者的3倍多ALK阳性肿瘤患者34,820例乳腺癌HER2阳性患者49,631例驱动突变肿瘤的每年发病数中国肿瘤登记年报，2012CML10,000例左右三大指南权威推荐

ALK阳性NSCLC诊断方法规范中华医学会三大指南推荐

ALK阳性NSCLC的诊断目的：提高我国ALK+NSCLC领域诊断的规范化水平背景：中国肺癌发病率、死亡率均居癌症首位。ALK阳性NSCLC已成为NSCLC一个特定亚型中国ALK阳性NSCLC总患者数约为35000人，是HER2阳性乳腺癌患者的70%，CML患者的3倍多

因此：如何准确诊断这些ALK阳性NSCLC患者是当务之急。中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期主要内容：ALK阳性NSCLC的诊断ALK阳性NSCLC的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期中华结核呼吸科杂志2014年3月第27卷第3期主要内容：ALK阳性NSCLC的诊断ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期中华结核呼吸科杂志2014年3月第27卷第3期ALK阳性NSCLC命名的由来2007,Soda&Mano首次发现EML4-ALK基因2009,AliceT.Shaw首次出现EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的称谓，并将其定义为NSCLC的独特亚型2010,KwakEL:证实克唑替尼治疗有效，但仍沿用EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的称谓SodaM,etal.Nature2007;448(7153):561-566.ShawAT,etal.JClinOncol2009;27:4247-4253.KwakEL,etal.NEnglJMed2010;363:1693-1703.EML4-ALKpositiveALKrearrangementpositiveALKfusionpositive

ALKIHCpositiveALKpositiveALK阳性NSCLC定义ALK阳性非小细胞肺癌：是指包括ALKFISH检测阳性、ALK序列融合变异或ALK融合蛋白表达阳性的肺癌，肿瘤细胞中存在ALK融合基因表达，是非小细胞肺癌的一个分子亚型，常见于腺癌，该类患者通常可从ALK抑制剂治疗中获益。张绪超等.中华病理学杂志2013;42(6):402-406.ALK阳性NSCLC具有鲜明的

临床及病理特征特征EGFR突变EML4/ALK组织学腺癌TTF1+腺癌TTF1+亚型非粘液型粘液型吸烟状态不吸烟不吸烟人种东亚所有人种发病年龄66岁52岁性别女性无差异ShawAT,etal.JClinOncol2009;27:4247-4253.ALK阳性NSCLC年龄50岁左右偏年轻中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期中华结核呼吸科杂志2014年3月第27卷第3期细胞外黏液黏液筛状结构印戒细胞微乳头结构砂粒体主要内容：ALK阳性NSCLC的诊断ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期中华结核呼吸科杂志2014年3月第27卷第3期ALK阳性NSCLC的诊断-三大指南推荐适宜人群诊断方法中国EGFR与ALK阳性NSCLC诊断及治疗指南（2014）所有含腺癌成分的NSCLCFISH,

经权威机构批准的IHC与RT-PCR，其余IHC可做为筛选CSCO中国专家共识所有含腺癌成分的NSCLC，富集人群可优先检测FISH,VentanaIHC,RT-PCR,常规IHC可做初筛晚期非小细胞肺癌分子靶向治疗专家共识所有含腺癌成分的NSCLCFISH,RT-PCR，VentanaIHCCFDA（中国国家药监局）

VentanaIHCAmoyRT-PCR

FISH中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期中华结核呼吸杂志2014年3月第37卷第3期所有含腺癌成分的NSCLC需常规检测

EGFR&ALK“先检测，后治疗”的NSCLC靶向个体化治疗模式已成为临床的诊疗规范

EGFR

&ALK是NSCLC已知的“高频”驱动基因，且有靶向药物治疗ALK驱动基因变异的患者接受靶向治疗，中位OS可达4.3年1KrisMG,etal.JAMA2014;311:1998-20062015NCCNV4关于分子检测的推荐小标本鳞癌诊断存在误差:首次诊断为鳞癌再次重复评估诊断腺癌或者腺鳞混合PK.Paik,etal.MolCancerTher.2012.Patient#AgeGenderBiopsy#1^Biopsy#1MutationBiopsy#2^BestresponsetoEGFRTKITTPonTKI(months)1(1)61MSquamous(L1)†exon19delAdenosquamous(LLLlung)PR12.12(2)71FSquamous(RLLlung)†exon19delAdenocarcinoma(RLLlung)Unavailable19.63(3)58FSquamous(RULlung)exon19delAdenosquamous(LLLlung)†SD23.64(4)45FSquamous(sacrum)exon19delAdenocarcinoma(pleuralfluid)UnavailableUnavailable5(5)46MSquamous(Rlung)exon19delAdenocarcinoma(SCLN)PR5.0+6(6)73MSquamous(adrenal)exon19delAdenocarcinoma(SCLN)UnavailableUnavailable7(10)58MSquamous(bronchus)L858RSquamous(T8)PR1.98(new)76MSquamous(Rlung)†insufficientAdenocarcinoma(Llung)PR5.39(new)68MSquamous(Llung)L858RNonePR2.8+10(new)30FAdenosquamous(Rlung)L858RNonePR8.411(new)50MAdenosquamous(Llung)exon19delNonePR9.2+“中国ALK阳性非小细胞肺癌诊疗指南”更新专家推荐：

晚期NSCLC患者使用ALK酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗前必须检测ALK融合变异状态。推荐所有含腺癌成分的NSCLC，应在诊断时常规进行ALK融合基因或融合蛋白检测（1类）。对于小活检标本或者不吸烟的鳞癌患者也建议进行（1类）。检测前应有送检样本的质控包括亚型确认和样本量确认。送检样本类型包括手术样本、活检组织样本、细胞学样本和细胞蜡块。对于部分活检组织标本临床取材小样本的局限性，有时无法保证肺腺癌的准确诊断，应考虑对不能判断组织学类型的肺癌（NOS）也进行ALK检测（1类）。专家推荐：对于送检样本ALK融合和EGFR突变双阴性的患者，NCCN指南推荐进一步检测ROS1的重排，考虑到小活检样本的有限性，关于ROS1的检测，在患者的允许下，推荐ROS1和ALK、EGFR同时检测（IIA类）。目前关于ROS1检测方法还没有完全统一，建议有条件的实验室先进行ALK/ROS1的免疫组化检测，检测结果阳性的患者，进一步使用FISH或者RT-PCR确诊。为了避免样本浪费和节约检测时间，对于晚期NSCLC活检样本，建议一次性切出需要诊断组织类型和ALK/EGFR检测的样本量，避免重复切片浪费样本（1IA类）。有研究表明，在我国年龄是ALK阳性NSCLC一项显著的独立预测因子，在年轻NSCLC患者中，发生ALK融合的概率显著高于发生EGFR突变的概率15，因此对于样本量有限不能满足同时检测ALK/EGFR检测的样本，对于年龄相对比较年轻的患者，建议优先检测ALK融合状态（IIB类）。“中国ALK阳性非小细胞肺癌诊疗指南”更新主要内容：ALK阳性NSCLC的诊断ALK阳性非小细胞肺癌的定义ALK检测适宜人群ALK检测诊断流程专家共识中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期中华结核呼吸科杂志2014年3月第27卷第3期ALK异常形式及检测方法DNAALKALKALKALKALKALKALKALKALKALKEML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4TFGKIF5BALKALKALKALKALKALKALKALKALKALKEML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4TFGKIF5BALKALKALKALKALKALKALKALKALKALKEML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4TFGKIF5BE13;A20E6;A20E20;A20E14;A20E18;A20E15;A20E2;A20KIF5B-ALKE17;A20TFG-ALKEML4-ALKE14;A20KIF5B-ALKTFG-ALKEML4-ALKmRNAProteinALKTyrosineKinaseactivationFISHReal-timePCRIHCFISH3’5’在中国批准的ALK诊断试剂盒ALKbreak-apartFISHassay(AbbottMolecular,Vysisprobes)ALKimmunohistochemistry(RocheVentana)SplitIsolatedredAmoyDxEML4-ALK融合基因检测试剂盒（厦门艾德）阴性或未知；据组织类型选择合适技术§新鲜标本VentanaIHC常规IHC检测*

阳性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者石蜡标本3+/2+/1+阴性ALK阳性非小细胞肺癌EGFR突变检测中华病理学杂志2013年6月第42卷第6期NSCLC活检组织标本卫生部诊疗规范及三大指南推荐FISH（Abbott）VentanaIHC（Roche）RT-PCR（Amoy）均可用于诊断ALK阳性NSCLC任一阳性即可诊断对一种方法有怀疑时可选用另外两种方法进行验证卫生部诊疗规范及三大指南推荐FISH（Abbott）VentanaIHC（Roche）RT-PCR（Amoy）

2p23ALKFISH检测原理normal3’5’RearrangementpositiveinversionwithEML4-ALK

fusionRearrangementNegative细胞内阳性信号几种常见形式（1）融合信号和橙/绿色分离信号（为经典的、主要的阳性信号形式）；（2）融合信号和单独的橙色信号（绿色信号缺失）；（3）单独的橙/绿分离信号。

Vysis

®ALKFISH:ALKDualColorBreakApartRearrangementProbe阴性细胞阳性细胞判断方法优势：分离信号，直观可信；大部分病例敏感，易判断。不足：对细胞量少的病例；接近cutoff病例；保存年份久/前处理欠佳的病例；无信号，部分信号弱其他异常信号特征的判断及其价值：需要进一步验证

单拷贝？以单独绿色信号？（5’-缺失）检测体会FISH方法问题：假阴性Split-signalFISHResult:假阴性假阴性Microscope:Sample/nucleus:Slide:FISH方法:

15%阳性细胞Cutoff值的合理性

1426例NSCLC患者接受FISH检测FISH阳性细胞数患者占比0%-9%79.3%10%-15%8.5%16%-30%1.4%31%-50%2.7%>50%8.1%DR.Camidge,etal.Cancer2013DiscrepanciesbetweenFISHandimmunohistochemistryforassessmentoftheALKstatusareassociatedwithALK'borderline'-positiverearrangementsorahighcopynumber:apotentialmajorissueforanti-ALKtherapeuticstrategies.IlieMI1,BenceC2,HofmanV3,Long-MiraE1,ButoriC2,BouhlelL4,LalvéeS2,MourouxJ5,PoudenxM4,OttoJ6,MarquetteCH7,HofmanP8.

AnnOncol.2015Jan;26(1):238-44.M.IIlie,etal.AnnalsofOncology,2014176例肺腺癌患者使用FISH、VentanaIHC、PCR检测ALK状态

1例患者FISH阳性，IHC阴性，克唑替尼效果不佳

5例FISH临界阳性患者，克唑替尼疗效与Cmet状态有关FISH

bordline阳性，IHC阴性患者接受克唑替尼治疗效果不佳FISH不典型，IHC阳性患者接受克唑替尼治疗有效卫生部诊疗规范及三大指南推荐FISH（Abbott）VentanaIHC（Roche）RT-PCR（Amoy）

免疫组织化学检测ALK融合蛋白

优势:可用于常规检测、快速、性价比高IASLCATLASofALKTestinginLungCancer,Chapter4,2013生物学基础：ALKmRNA正常状态下，仅微量存在与小肠大脑等，肺部未检出；未发生ALK融合的肺癌，ALK蛋白几乎不表达VentanaIHC试剂设计ALK融合蛋白:无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白部分ALK融合蛋白表达较低VentanaIHC的原理:使用具有高度敏感性和特异性的一抗——D5F3全自动仪操作，充分保证特异性独有Optiview扩增技术，充分保证敏感性D5F3rabbittmonoclonalantibodyOptiviewDABIHCDetectionOptiviewAmplificationKit双向结果:

大部分病例“阳”或“阴”敏感性高:

均为强阳性颗粒，不用判断强度和百分比重复性好:

不同人判断无肿瘤细胞量要求VENTANA®anti-ALK(D5F3)IHC检测优势Ventana

IHC与FISH检测结果比较FISH总数敏感性特异性一致率阳性阴性VentanaIHC(1)阳性46753100%98.20%98.40%阴性0377377VentanaIHC(2)阳性3103194%100%99.10%阴性2198200VentanaIHC(2)阳性32032100%100%100%阴性0217217VentanaIHC(3)阳性4024291%96%94%阴性45357VentanaIHC(4)阳性1801890%100%99.60%阴性2503505(1)JinghuiWang,etal.PLoSONE20149(7):e101551(2)EugenC.Minca,etal.JMolDiagn2013,15:341-346(3)MurryW.Wynes,etal.JThoracOncol.2014;9:631–638(4)Greta,etal.ArchPatholLabMed.doi:10.5858/arpa.2013-0388-OAIHC典型阳性、阴性病例IHC阳性（FISH阳性）IHC阴性（FISH阴性)复旦大学附属肿瘤医院资料VentanaIHC可重复性高全自动检测，避免操作流程中的误差，可重复性好VentanaALK(D5F3)的CFDA注册临床实验

三家公立医院超过1100例NSCLC样本进行VentanaALK(D5F3)与FISHALK结果的对比验证实验结果表明VentanaALK(D5F3)与FISHALK的一致性为99.23%VentanaIHC试剂盒已于2013.8已于2013.8已于2013.8获得CFDA批准LDK378全球III期临床使用VentanaIHC做为伴随诊断方法LDK378VersusChemotherapyinPreviouslyUntreatedPatientsWithALKRearrangedNon-smallCellLungCancer（NCT01828099）EstimatedEnrollment:348StudyStartDate:July2013EstimatedStudyCompletionDate:June2018InclusionCriteria:Patienthasahistologicallyorcytologicallyconfirmeddiagnosisofnon-squamousNon-smallcelllungcancer(NSCLC)thatisAnaplasticlymphomakinase(ALK)positiveasassessedby

theVentanaImmunohistochemistry(IHC)test.ThetestwillbeperformedatNovartisdesignatedcentrallaboratories.PatienthasnewlydiagnosedstageIIIB(whoarenotacandidatefordefinitivemultimodalitytherapy)orstageIVNSCLCorrelapsedlocallyadvancedormetastaticNSCLCnotpreviouslytreatedwithanysystemicanti-cancertherapy(e.g.cytotoxicdrugs,monoclonalantibodytherapy,crizotiniborotherALKinhibitors,orothertargetedtherapies,eitherexperimentalornot),withexceptionofneo-adjuvantoradjuvanttherapyPatienthasatleastonemeasurablelesionasdefinedbyRECIST1.1.ApreviouslyirradiatedsitelesionmayonlybecountedasatargetlesionifthereisclearsignofprogressionsincetheirradiationAlectinib全球III期临床亦使用VentanaIHC做为伴随诊断方法ALEXStudy:ARandomized,PhaseIIIStudyComparingAlectinibWithCrizotinibinTreatment-NaiveAnaplasticLymphomaKinase(ALK)-PositiveAdvancedNon-SmallCellLungCancer(NSCLC)Patients(NCT02075840)EstimatedEnrollment:286StudyStartDate:August2014EstimatedStudyCompletionDate:December2017InclusionCriteria:Histologicallyorcytologicallyconfirmeddiagnosisofadvancedorrecurrent(StageIIIBnotamenableformultimodalitytreatment)ormetastatic(StageIV)NSCLCthatisALK-positiveasassessedbytheVentanaIHCtestAge>/=18yearsoldLifeexpectancyofatleast12weeksECOGPSof0-2Patientshadnopriorsystemictreatmentforadvancedorrecurrent(StageIIIBnotamenableformultimodalitytreatment)ormetastatic(StageIV)NSCLCAdequaterenal,hematologicandliverfunctionPatientsmusthaverecoveredfromeffectsofanymajorsurgeryorsignificanttraumaticinjuryatleast28daysbeforethefirstdoseofstudytreatmentMeasurabledisease(byRECISTv1.1)priortotheadministrationofstudytreatmentPriorbrainorleptomeningealmetastasesallowedifasymptomatic(e.g.,diagnosedincidentallyatstudybaseline).AsymptomaticCNSlesionsmightbetreatedatthediscretionoftheinvestigatorperlocalclinicalpractice.IfpatientshaveneurologicalsymptomsorsignsduetoCNSmetastasis,patientsneedtocompletewholebrainradiationorgammaknifeirradiationtreatment.Inallcases,radiationtreatmentmustbecompletedatleast14daysbeforeenrollmentandpatientsmustbeclinicallystableUseofhighlyeffectivecontraceptionasdefinedbythestudyprotocolVENTANA®ALKIHC不足之处假阴性：（1）受固定时间和类型影响:

atleast6hoursin10%neutralbufferedformalin(NBF)orzincformalin.Fixationtimesandtypesotherthanrecommendedcanleadtofalsenegativeresults.（2）切片时间不能长:

within3monthsofsectioning.LossofstainingperformancehasbeenobservedwiththeVENTANAanti-ALK(D5F3)onsectionsthathavebeenstoredatroomtemperatureforlongerthan3months.假阳性：小细胞肺癌？鳞癌？非特异染色？阳性强度？

卫生部诊疗规范及三大指南推荐FISH（Abbott）VentanaIHC（Roche）RT-PCR（Amoy）

Real-timePCRdetectionofALKfusionmRNA样品编号6艾德EML4-ALK结果RT-PCR结果FISH结果1MutationV1FISH+2Mutation

FISH+3MutationV2FISH+4MutationV3a/bFISH+5MutationV1FISH+6MutationV3a/bFISH+7MutationV1FISH+8MutationV3a/3bFISH+9MutationV2FISH+10MutationV3bFISH+11MutationV3a/bFISH+12MutationV1FISH+13MutationV2FISH+14MutationV2FISH+15MutationV1FISH+16MutationV1(EML4E10a/b,E13:A20)FISH+17MutationV1FISH+18MutationV1FISH+19MutationV1FISH+20MutationV1FISH+21MutationV1FISH+22MutationV1FISH+23Mutation

FISH+24MutationV3a/b(E6a/b:ALKintron18bp:E20FISH+25MutationV3a/bFISH+26MutationV1FISH+27WT

FISH+28WT

FISH+29WT

FISH+30WT

FISH+Real-timePCRn=9830

FISH(+)26RT-PCR(+)Sensitivity:26/30(86.7%)Real-timePCRdetectionofALKfusionmRNA(ourexperience)RACE-PCR或RT-PCR：融合序列捕获的确定性

Takeuchietal.ClinCancerRes2008;14(20):6618Zhangetal.Molecularcancer2010肿瘤医院数据分享临床前研究：400例（多中心共1000多例）临床病例检测：

FISH——2011.12~2015.02

1086例IHC——2013.1~2015.021024例（ventana)

同时做FISH和IHC：807例肺腺癌中ALK重排

FISH法检测肺癌中ALK基因重排

例数比例（%）阴性922922/1042(88.5%)阳性120120/1042(11.5%)无法判读4444/1086(4.05%)合计1086

ALKprevalenceinChinaAuthorALKincidencePublicationsZhangX,WuYLetal.11.6%(12/103)MolCancer2009Wong,etal.(Hongkong)4.9%(13/265)Cancer2009LiH,ChenHQ,etal.3.0%(7/230smokers,AC)LungCancer2012SunY,ChenH,JiH,etal.5.8%(3/52surgicalAC,non-smokers)JCO2010WuSG,YangPC,etal.(Taiwan)34%(39/116,AC,WTEGFR)JTO2012RikovaK,etal4.7%(6/137)Cell2007WangZ,WangJ,etal.9.7%(11/113,StageIV)Oncology2012RenS,ZhouC,etal.9.6%(10/104,Female,AC,non-smoker)CellBiochemBiophys.2012;Cancer2012[GLCIinternaldata:7%(70/977);7.7%(31/400)]ALK重排与EGFR突变ALK重排与EGFR突变状态的关系

例数ALK阳性例数（%）EGFR无突变40479(16.4%)EGFR有突变3241(0.031%)合计82880(9.7%）ALK重排不同检测比较FISH与VentanaIHC检测ALK易位结果比较

IHC

阴性阳性无法判读合计阴性67845687FISH阳性178382无法判读326038

合计711888807FISH和