回归课本之新教材的查缺补漏-13基因工程(PCR技术)(解析版)

回归课本之新教材的查缺补漏-13基因工程（PCR技术）1、反应过程：PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。2、实验操作（1）PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定的DNA聚合酶、两种RNA引物、水。（2）实验操作步骤：①按照PCR反应体系配方配制反应液；②将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；③将微量离心管放到PCR仪中；④设置PCR仪的工作参数；⑤DNA在PCR仪中大量扩增。1．关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是（

）A．PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度B．PCR反应体系中的10倍浓缩的扩增缓冲液中含有Mg²⁺、4种脱氧核糖核苷酸等成分C．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理D．电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶导致凝胶加样孔中的电泳样液流出2．下图为利用逆转录方法和PCR技术扩增目的基因片段的过程示意图。据图分析，下列说法错误的是（

）A．③过程使用90～95℃的高温处理是为了让目的基因充分变性B．⑤过程使用70～75℃的温度处理既可以防止DNA变性，还能促进子链的延伸C．④过程两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合D．若RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则其逆转录合成的双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%1.引物存在的必要性DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核苷酸加至已有核酸链的游离3'-羟基上，而不能使脱氧核糖核苷酸自身发生聚合，即它需要引物链的存在。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基互补配对。细胞内DNA复制以RNA作引物，从新合成的冈崎片段上发现含有一短暂存在的小的RNA片段附着在5'端这一事实，可说明DNA复制时需要RNA引物，这些引物长5~10bp，现已知RNA引物的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的。PCR反应以DNA作引物。2、引物的作用DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3'端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链。不同的引物可结合不同的目的基因并进行扩增。3、设计引物的原则引物是根据目的基因特有的一段已知的核苷酸序列设计合成的，能与目的基因的模板链通过碱基互补配对特异性地结合。设计引物的主要原则：①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合；②引物与靶序列间的Tm不应过低；③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；④2个引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列，在3'端不应有任何互补的碱基；⑤引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%。4、引物的处理由于引物延伸从3'端开始，3'端不能进行任何修饰，引物5'端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5'端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与运载体正常结合，需要在2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列。在2种引物的5'端上添加不同的限制酶识别序列，是为了保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化。5、引物的特点①引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合;②2种引物之间不能互补配对;③某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对;④需要在2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列;⑤引物不能太短。3．PCR又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。下列有关PCR的叙述错误的是（

）A．以DNA半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行B．耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸C．反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物4．新冠病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。制备重组亚单位新冠疫苗的线路是：提取新冠病毒RNA→通过RT-PCR（反转录酶聚合酶链式反应）技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因（图1）→构建基因表达载体（图2）→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。图3为利用电泳技术对PCR的产物进行纯度鉴定，1号泳道为标准（Marker），2号泳道为阳性对照组，3号泳道为实验组。下列相关叙述错误的是（

）A．利用RT-PCR技术获取RBD蛋白基因时，需加入逆转录酶、TaqDNA聚合酶B．利用PCR扩增含有限制酶切点的RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5C．2号泳道是以（提纯的）RBD蛋白基因片段为材料所做的阳性对照组D．为提高目的基因和运载体的正确连接效率，应选择限制酶EcoRI切割PCR的原理是DNA分子的半保留复制，所以要根据DNA分子的2条模板链设计2种引物。PCR循环时需要的引物数量的计算有2种方法。方法1∶第n次循环产生的DNA数为2"，根据DNA分子的半保留复制可知，需要的引物数为2n个，从第1次循环开始，需要引物的个数依次为2个、22个、23个……2n个，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2+21+22+……+2n=2n+1-2。方法2∶PCR经过n次循环产生的DNA数为2"，一共有2"'条链，其中有2条链是DNA母链，不含引物，其他的每1条链均含1个引物，并且2种引物的数量相等，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是2n+1-2，需要某一种引物的总个数是（2n+1-2）×1/2=2n-1。2n个DNA中，一个DNA由1条母链和第1种引物延伸的子链组成，另一个DNA由另一条母链和第2种引物延伸的子链组成，其他的DNA均由2种引物延伸的2条子链组成。5．新冠疫情的快速控制，离不开我国政府的科学决策和对新冠病毒（一种RNA病毒）的快速检测能力。荧光定量PCR可定量检测样本中DNA含量，其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针并生成荧光分子，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图），荧光监测系统随时接收荧光信号变化。每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次数称为循环阈值（Ct值）。下列说法正确的是（

）A．细胞内DNA复制的引物种类与PCR所用引物种类相同B．一个初始DNA分子经过4次循环后，得到6个等长的DNA分子C．Ct值越大，被检测样本中病毒数目越多，对被检测者的危害性越大D．最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本DNA的含量呈正相关6．PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷酸）是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是（

）A．图示环节所需的温度比上一个环节的低B．dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端C．Taq酶催化相邻的dNTP间形成磷酸二酯键D．经过1个循环后，获得的子代DNA的双链中脱氧核苷酸数量相同PCR的每次循环可分为3步：1、变性（90~95℃）变性的温度与目的基因中G+C含量有关；变性时间的长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，变性的时间就越长。2、复性（55~60℃）复性是让2种引物通过碱基互补配对与2条单链DNA结合，复性的温度与引物中G+C含量有关，G-C碱基对间有3个氢键，A-T碱基对间只有2个氢键，引物中G+C含量较高，复性时温度就较高;复性时间的长短与引物的长短有关，引物越长，复性的时间就越长。3、延伸（70~75℃）延伸的温度不能太高，以防止新合成的子链DNA与母链DNA解聚为单链，延伸的温度也不能太低，是为了保证Taq酶的活性;延伸所需要的时间长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，延伸所需要的时间就越长。7．荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成（如图）。Ct值（循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是（

）A．检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNAB．PCR每个循环包括变性、复性（引物和模板结合）、延伸3个阶段C．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高D．若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性8．下列有关PCR的叙述，错误的是（）A．PCR的原理是DNA复制，解旋和复制是同时进行的B．PCR的过程主要包括变性→延伸→复性，温度逐渐降低C．PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制共需引物2n-1对D．每一循环都消耗引物和原料，需要在操作中及时补充1．重叠延伸PCRSOEPCR技术是1989年由Horton等创建的，它依据目的基因的核苷酸序列，将目的基因分为多条引物，设计多对具有互补末端的引物,先分段对模板进行扩增，再将PCR产物混合，通过重叠链的相互搭桥、互为模板而延伸，最终将不同来源的扩增片段重叠拼接起来（图1）。重叠PCR技术弥补了一般PCR技术对短于100bp和长度为几十bp片段DNA重组的困难，并可不依赖于内切酶的消化方式，简洁快速地获得PCR产物，有效避免加入的非目的基因序列的连接对目的基因的影响，从而在体外获得高质量的目的基因序列，而且目的产物特异性高，不需要构建DNA文库进行筛选。但由于该技术所使用的引物序列较长（“引发”部分和“重叠”部分，各约25~30bp），故该技术的退火温度较难把握，对实验的成功率造成很大影响。该技术在大片段基因的人工合成（如图2-a）、基因定点突变（如图2-b）等方面有广泛应用。大片段基因的人工合成是根据目的基因的序列,设计n条单链寡核苷酸片段为引物（如图2-a中P1~P15），相邻近的每2条引物之间均有15~25bp的序列反向互补。原理是先取中间4条单链的寡核苷酸引物P6、P7、P8和P9进行第1轮的PCR反应，得到目的片段后进行琼脂糖凝胶电泳回收。下面每轮循环都以上轮的PCR反应产物为模板，依次在两侧引入2条寡核苷酸引物，互为动态模板，最终实现目的基因的合成。基因定点突变是根据的基因的序列,设计4条单链寡核苷酸片段为引物（如图2-b中的引物A~D），其中2条引物（B、C）碱基序列反向互补，且此2条引物的中间为突变碱基。原理是取引物A、B进行PCR1反应，以及引物C、D进行PCR2反应，得到的2种目的片段分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。将回收的片段混合，片段互为模板和引物进行PCR3反应，最后以PCR3产物为模板，加入引物A、D完成PCR4反应，最终实现基因特定位置碱基的增添、缺失、替换。2．等位基因特异PCRAS-PCR又称作ARMS（amplificationrefractorymutationsystem），是由Newton等1989年研发的一种PCR技术,该技术的原理是:根据单核苷酸多态性（single-nucleotidepolymorphism，SNP）位点设计3′末端与SNP位点碱基互补或错配的特异PCR引物,通过凝胶电泳等方法检测PCR扩增产物的有或无,从而检测基因型中SNP（如图3）。根据等位基因WT和MT之间存在的1个核苷酸T-G的突变，设计引物1、2、3。其中引物1为公共引物，引物2与MT配对，与WT不配对，故引物1、2仅在MT中有扩增产物；同理，引物1、3仅在WT中有扩增产物。由于生物中SNP数量多、分布广、稳定性强，故该技术是一个快速、简便、可靠的检测基因型SNP的技术，也是有效开发SNP分子标记的方法。但该技术的反应体系有很高的灵敏性，对镁离子、Taq酶、dNTP的浓度要求比较严格，实际操作还需要多次预实验予以确定。图3.等位基因特异PCR原理3．热不对称性PCRTAIL-PCR技术是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的PCR技术，该技术由Liu和Whitter于1995年首先研究并报道，其原理是：利用一系列序列特异性的嵌套引物与一个短的简并引物指导扩增已知序列的侧翼序列的反应，由于两类引物的退火温度不同，可通过控制反应过程中的退火温度而有效地控制特异性和非特异性产物的扩增。操作时，根据目标序列旁边的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（specialprimer，SP1、SP2、SP3），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrarydegenerate，AD）组合，以基因组DNA作为模板，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异片段。第1轮PCR反应包括5次高严谨性反应、一次低严谨性反应、10次较低严谨性反应和12次热不对称的超级循环。首先，5次高严谨性的反应使长的高退火温度的特异引物SP1与已知的序列结合并延伸。此过程中目标序列呈直线式上升，由AD引物结合产生的非特异性产物的浓度较低，之后进行1次低退火温度反应，使简并引物结合到较多的目标序列上，接下来10次较低严谨性的反应使２种引物均能与模板互补配对，从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶DNA复制成双链DNA，为下一轮线性扩增模板做准备，最后进行12次热不对称的TAIL循环，使目的片段扩增量大大超过非目标片段。经过上述过程，得到浓度不同的３类产物：产物Ⅰ是在特异引物和任意引物之间扩增的，即目标产物（大量）；产物Ⅱ是单独由特异引物扩增的（大量）；产物Ⅲ是单独由任意引物引发的产物（少量）。接下来进行第2轮PCR反应，使产物Ⅰ的分子数逐渐升至最高，产物Ⅱ、产物Ⅲ基本不变。用稀释后的第2轮PCR产物为模板，进行第3轮PCR，最终获得目标产物为主的PCR产物（图4）。对此PCR产物进行测序，即实现从已知序列中分离到其邻近的未知侧翼序列这一目的。以基因组DNA作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3个较高退火温度的引物SP，和1个AD引物组合，通过特殊的热循环程序（低严谨PCR、高严谨PCR交替进行），使得特异性PCR产物得以有效扩增，从而获得已知序列的侧翼序列（图4）。TAIL-PCR方法直接通过3轮PCR反应得到目的片段，能弥补常规PCR不能对已知DNA序列侧翼的未知序列进行扩增的不足，从而快速分离到目标序列。但该方法对反应条件要求精准，其中任一轮出现失误，都将直接影响下一循环，进而影响实验结果；另外，由于引物组合较多，且AD引物存在有限的结合位点，即使使用不同的简并引物也有可能导致扩增不出产物。目前，TAIL-PCR在对基因侧翼序列的克隆中发挥了重要作用，在图位克隆、遗传图谱绘制、基因测序等方面也被广泛应用。图4.典型TALL-PCR流程4．荧光定量PCRFQ-PCR于1992由Higuchi提出设想，1995年由美国PE（PerkinElmer）公司研发，是一种在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号的积累，对整个PCR进程进行检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的PCR技术。例如Taq‐Man探针工作原理是探针保持完整状态时，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，不会检测到荧光。在PCR延伸过程中，探针被5′-3′核酸外切酶特异性地切割并释放5′端的荧光基团，发出荧光信号，荧光量与产物中双链的量呈正相关（图5、图6）。荧光定量PCR具有重复性好、特异性强、灵敏度高、定量精准、操作简便和自动化程度高等一系列优点，在基础生物学研究、食品检测、环境检测、医学诊断等领域有广泛应用。但该技术在操作的规范性（如检测样品的数量是否满足生物学重复和技术重复使用、实验室采用的统计方法对结果呈现的影响度等）、实验耗材的费用（荧光探针费用昂贵，且损耗快）等方面仍存在不足。图5.荧光定量PCR原理5．锅柄式PCR锅柄式PCR是一种环状PCR技术，该技术于1997年由Felix和Jones报道，采用已知的5′端序列和未知的3′端伴侣基因序列以形似一个锅和一个柄的模板扩增基因DNA，从而扩增2.0~9.0kb的大片段未知序列（如图7）。PanhandlePCR是高度特异性扩增与已知位点相邻大于3.0kb的人类基因组DNA的最佳技术。其已广泛运用于启动子、基因调节结构域定位、转座子整合位点测定等领域。图7.锅柄式PCR原理除上述5种常用新型PCR技术外，目前还有低变性温度PCR、AnglerPCR、脉冲PCR等多种PCR技术，他们都各有优势、各有侧重，在分子生物学研究领域发挥着重要作用。随着制造业的发展及其他技术的配合，定会有更多升级版、改进版的PCR技术问世，为基因结构和功能的研究提供更好的技术支持。9．利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是（）A．PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果B．引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基C．①过程需要先加热至90℃以上后再冷却至50℃左右D．②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD10．实时荧光定量PCR可用于对样品中特定DNA序列进行定量分析。将荧光标记的Taqman探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，在特定光的激发下R发出荧光，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(达到荧光阈值所经历的循环次数)。下列相关叙述正确的是（

）A．荧光基因R连接在探针的3’端B．该反应体系中并未加入ATP，所以新链的合成不需要消耗能量C．TaqDNA聚合酶在该反应中的作用是合成磷酸二酯键D．Ct值越小，说明样品中特定DNA序列的含量越多11．重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理见图。下列说法错误的是（

）A．过程②需要含Mg2+的缓冲液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等B．若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子C．经过过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过过程⑤获得目的基因D．过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物12．利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是（

）A．延伸的温度必须大于复性温度,而小于变性温度B．设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自连C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/1613．随着全球转基因作物大规模种植和全球一体化下频繁的贸易流通，转基因监管的任务将越来越重。为了还给消费者知情权和选择权，多个国家和地区对转基因产品实行标识管理制度，这些法规实施的前提就是要建立稳定、准确的转基因检测技术。PCR转基因检测技术被多国检测工作者使用，该技术通常包括核酸提取、核酸扩增、扩增产物检测3个步骤。某研究小组设计并完成了“转基因抗草甘膦大豆定性PCR检测”实验，请参与实验设计并回答相关问题（草甘膦为常用除草剂；转基因抗草甘膦大豆的外源基因构建图如图1所示）：图1抗草甘膦外源基因结构图（CaMV35S为外源启动子、NOS为外源终止子）(1)提取DNA：取待测大豆组织裂解破碎，进行DNA提取和纯化，得到待测大豆基因组DNA。该过程的常用的试剂有EDTA、SDS、NaCl、酒精等。在研磨液中加入NaCl的目的是________________，提取到的DNA可以用______________试剂鉴定。(2)DNA扩增：①在确定扩增对象后，从___________________中获得待扩增基因序列，以此为依据可设计引物。该小组拟定的引物设计如表所示，其引物设计有一个是不科学的，请指出并说明原因____________。基因引物序列产物片段大小基因来源LectinF－5'GCCCTCTACTCCACCCCCATCC－3'R－5'GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG－3'118内源基因CaMV35SF－5'GGGATT－3'R－5'AATCCC－3'195外源基因NOSF－5'GAATCCTGTTGCCGGTCTTG－3'R－5'TTATCCTAGTTTGCGCGCTA－3'180外源基因CP4－EPSPSF－5'CTTCTGTGCTGTAGCCACTGATGC－3R－5'CCACTATCCTTCGCAAGACCCTTC－3320外源基因注：内源基因指大豆基因组内基因，外源基因指大豆基因组外基因。②PCR扩增：在4个反应体系中分别加入________________（模板）、相应引物、________________酶、________________等，并将PCR仪的温度设定为：变性94℃30s、复性58℃30s、延伸72℃40s，循环30次。“延伸”的温度设定为72℃，是因为该温度下________________。在设定的PCR体系下可以特异性扩增目标DNA片段，主要是因为__________________________________具有特异性。(3)扩增产物检测：可采用________________的方法检测。部分实验结果如图2、3所示。据图2初步判断，该大豆为________________（填“转基因”或“非转基因”）大豆。据图2、图3分析，其实验结果是________________（填“可信的”或“不可信的”）。注:M:标准参照物，1：阳性对照（基因标准品），2：阴性对照（普通大豆），3：核酸提取空白对照，4：待鉴定样本14．新型冠状病毒的结构如图甲所示。病毒外有包膜，这层包膜主要来源于宿主细胞膜，包膜还含有病毒自身的糖蛋白，其中糖蛋白S可与人体细胞表面的ACE2蛋白结合，从而使病毒识别并侵入宿主细胞。新型冠状病毒是一种单股正链RNA病毒，以ss（+）RNA表示。图乙表示新冠病毒在宿主细胞内增殖过程，回答下列问题。(1)新冠病毒的糖蛋白S可与人体细胞表面的ACE2蛋白结合体现了膜的_____________功能，研究表明吸烟更容易感染新冠病毒，可能的原因是_____________。(2)推测新冠病毒进入宿主细胞后，在_____________（细胞器）的作用下脱去包膜，暴露出遗传物质。据图分析新冠病毒增殖的过程中遗传信息的传递方向是_____________（用文字和箭头表示）。(3)新冠病毒核酸检测可采用实时荧光定量PCR技术，1~2h内即可得到检测结果。图丙表示该技术的基本流程，其原理是PCR扩增过程（一种体外大量扩增DNA的技术）中加入与特定模板链互补的荧光探针，再通过检测产物的荧光信号即可确定是否为阳性。①图中酶A为_____________，酶B能水解杂化双链中的_____________（填“DNA”或“RNA”），酶C的作用类似于DNA聚合酶，推测其起作用时______________（填“需要”或“不需要”）模板。②PCR扩增过程的原理是_____________。15．在聚合酶链式反应（PCR）中，除了作为复制对象的长链DNA之外，反应溶液中还添加有作为引物的短链DNA、dNTP（脱氧三磷酸核苷酸，N表示任意某一种碱基）和酶。实验时需要使反应溶液的温度周期性地发生变化以完成“变性—复性—延伸”的循环。DNA复性温度与互补碱基对之间的氢键数呈正相关。(1)PCR反应溶液中添加的酶为______，作用是______。(2)实验1：在图1的引物1到引物4中，只使用1种作为引物，复性的温度设定为T℃，PCR后只合成出了与模板DNA2相同的单链。该实验使用的引物是______。实验2：将引物变更为图1中的引物3和引物4，其他条件与实验1相同的情况下进行PCR双链DNA完全没有被复制，请在答题卡中，将引物3和引物4与模板链结合的关系绘制出来。______(3)实验3：对图2中的双链DNA，使用引物5和引物6，将复性的温度设定为T℃，进行了PCR。结果是双链DNA完全得不到复制。而当设定温度改变后，双链DNA得到了复制。温度改变的大致思路是______。(4)实验4：PCR技术与电泳鉴定结合进行DNA测序。以待测序的DNA链作为模板链，使用3′TATA……ATGCGCA-5′末端结合了高灵敏度检测化合物X的DNA单链序列作为引物，在第1次实验中，用dNTP进行反应。第2次实验，在第1次实验使用上述dNTP的基础上，将反应混合物分为四个试管，分别加入四种双脱氧三磷酸核苷酸即ddNTP，即核苷酸在2、3号都脱氧（ddATP、ddCTP、ddTTP、ddGTP，结构见图4），每个试管只加一种。第1次与第2次实验四支试管，在经过相同的温度变化循环后，对反应溶液进行了适当的处理，使全部的DNA以单链DNA的形式存在。使用能区分开一个碱基长度差异的凝胶电泳法对含有化合物X的单链DNA进行分析，获得了如图5所示的结果。①ddNTP一旦参与聚合反应，则DNA单链延伸即终止，原因是______。②请根据下图写出模板链碱基序列：______16．盐芥是十字花科盐芥属植物，因生长于农田区的盐渍化土壤而得名。为研究盐芥iTS基因在植物逆境胁迫应答中的重要作用，科研人员做了一系列研究。(1)取待测盐芥组织裂解破碎，进行DNA提取和纯化，得到待测盐芥基因组DNA。该过程常用的试剂有EDTA、SDS、NaCl、酒精等。在研磨液中加入NaCl的目的是_____________；纯化DNA时可使用酒精，是因为_____________________________。(2)为了特异性扩增iTS基因序列，需根据_____________设计特异性引物。在反应体系中加入相应物质和原料后，将PCR仪的温度设定为：变性94℃（30s）、复性58℃（30s）、延伸72℃（40s）。“延伸”的温度设定为72℃，是因为该温度下_____________。若iTS基因的数量为a个，上游引物数∶下游引物数=1∶50，该体系扩增进行5轮循环后，上游引物刚好耗尽，则上游引物的数量等于_____________条。(3)用限制酶M切割某DNA分子，过程如图1所示，其中虚线部分为盐芥iTS基因。图1中的DNA分子上限制酶M的切割位点有_____________个，它能够特异性识别的序列是_____________，下图2中能与iTS基因进行重组的Ti质粒是_____________。（所示碱基序列为不同载体中方框内的序列）(4)将获得的重组质粒通过____________法导入大豆愈伤组织中，最终获得转基因大豆植株，iTS基因能否在大豆植株体内维持和表达其遗传特性的关键是____________。(5)为验证iTS基因能提高大豆的耐盐性，研究人员进行了以下实验，结果如下表所示。大豆类型处理方式叶片中叶绿素含量根部细胞渗透压野生型大豆0.15mol/L的NaCl溶液处理低低转iTS基因大豆高高综合上述研究，iTS基因能提高植物耐盐性的机理是_______________________________。参考答案：1．A【分析】RCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。【详解】A、PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度，用于完成DNA的扩增，A正确；B、10倍缓冲液中不包含dNTP，B错误；C、为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压蒸汽灭菌，C错误；D、电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1mm为宜，D错误。故选A。2．D【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。【详解】A、③过程为变性，变性过程使用90～95℃的高温处理是为了让目的基因的双链解开，充分变性，A正确；B、⑤过程为延伸，延伸过程使用70～75℃的温度处理既可以防止DNA变性，还能促进子链的延伸，B正确；C、④过程为复性，复性过程使用55℃的温度处理，使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，C正确；D、RNA中含有U，DNA中不含有U，含有T，D错误。故选D。3．B【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。【详解】A、PCR是体外进行DNA复制，以半保留复制为原理，为了维持反应的稳定，反应需要在缓冲液中进行，A正确；B、耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，B错误；C、反应过程中的每一轮循环依次包括变性（高温解旋）、复性（引物结合）、延伸（子链延伸）三步，C正确；D、常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，D正确。故选B。4．D【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，利用的原理是DNA复制，需要条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶），过程包括：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。【详解】A、RT-PCR技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入逆转录酶、Taq酶，A正确；B、引物与模板链的3'端碱基互补配对，故引物1、引物2、引物7和引物8不合适，扩增得到的RBD蛋白基因也应该含有限制酶的酶切位点，故引物3和引物6不合适，故选引物4和引物5，B正确；C、PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker），2号泳道是以RBD蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组，C正确；D、质粒上没有SmaⅠ酶切位点，且若使用EcoRⅠ酶切，易造成目的基因和质粒自身环化，故应该选择BamHⅠ和HindⅢ，D错误。故选D。5．D【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量的原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。【详解】A、细胞内DNA的复制时，引物是通过RNA聚合酶合成的RNA链，而PCR反应中所需的引物是人工合成的DNA或RNA链，A错误；B、一个初始DNA分子经过4次循环后，得到8个等长的DNA分子，B错误；C、Ct值越小，说明所需循环的次数越少，可以理解为样本中的病毒含量相对较高，越容易被检测到，而Ct值越高，说明所需循环的次数越多，检测到时需要更多的时间与循环，提示样本中病毒的含量相对较少，即新冠病毒含量越少，Ct值越高，新冠病毒含量越多，Ct值越低，C错误；D、题干中提出“加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，D正确。故选D。6．D【分析】1.PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在体外复制特定的DNA的核酸合成技术。2.原理：DNA复制。3.条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶（Tag酶）。【详解】A、图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度比变性的温度低，A正确；B、在PCR扩增中，脱氧核苷酸只能连接在3'端，所以dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端，B正确；C、Tag酶催化形成磷酸二酯键，磷酸二酯键是相邻的两个脱氧核苷酸之间形成的，C正确；D、由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，得到的两个DNA片段中脱氧核苷酸的数量不一定相同，D错误。故选D。7．C【分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。【详解】A、新冠病毒的遗传物质是RNA，因此，检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNA，A正确；B、PCR技术中每个循环均包括变性、复性（引物和模板结合）、延伸3个阶段，一个循环后DNA数量增加一倍，B正确；C、Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越少，患者危险性更低，C错误；D、若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，则逆转录无法得到相应DNA，检测结果可能为阴性，D正确。故选C。8．ABD【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，该技术的原理是DNA复制，实现的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物，其他的条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。【详解】A、由分析可知，PCR的原理是DNA复制，该过程中解旋和复制不是同时进行的，A错误；B、PCR的过程主要包括高温变性→低温复性→中温延伸，可见该过程中不是温度逐渐降低，B错误；C、PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制产生的子代DNA数目为2n个，其中的单链数目为2（n+1）个，每个子链的延伸都需要引物，即除了两条最初的模板链中没有引物，因此该过程中共需引物2n-1对，C正确；D、PCR过程中的引物和原料是一次性添加的，不需要补充，D错误。故选ABD。9．D【分析】多聚酶链式反应扩增DNA片段：PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。【详解】A、PCR技术中DNA单链延伸的方向是沿着引物的5'端向3'端延伸的，据此可分析，PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果，A正确；B、根据突变位点的产生可推知，引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基，B正确；C、①过程是双螺旋解开的过程，即氢键断裂可通过先加热至90～95℃完成，而后再冷却至55～60℃使氢键形成，为子链的延伸做准备，C正确；D、②过程为子链延伸的过程，该过程需要利用AB上链和CD下链之间的互补配对实现子链的延伸过程，D错误。故选D。10．D【分析】实时荧光定量PCR技术中，TaqDNA聚合酶有两个作用，一是形成子链的磷酸二酯键，二是水解探针，破坏磷酸二酯键；破坏探针导致荧光出现，Ct值越大，即是荧光强度越大，说明样品中特定DNA序列的含量越多。【详解】A、因为引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，从图中引物1的方向可以分析出，R端是5'端，A错误；B、该反应体系中并未加入ATP，但新链的合成需要消耗能量，解旋的能量来自于高温，聚合的能量来自于原料，B错误；C、在该反应中TaqDNA聚合酶有两个作用，一是形成子链的磷酸二酯键，二是水解探针，破坏磷酸二酯键，C错误；D、Ct值越小，达到荧光阈值所经历的循环次数越少，说明样品中特定DNA序列的含量越多，D正确。故选D。11．B【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。【详解】A、过程②为PCR反应，需要在一定的添加Mg2+的缓冲液中才能进行，需提供模板DNA、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等，A正确；B、两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故总共形成3种DNA分子，B错误；C、过程④获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；D、过程⑤是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D正确。故选B。12．D【分析】用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物（两种）。引物与模板链结合后，耐高温的DNA聚合酶使子链从引物的3'端延伸。【详解】A、变性是使DNA双链解旋，需要较高温度；复性目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，需要温度较低，延伸的温度必须大于复性温度，而小于变性温度，A正确；B、设计引物时，需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连，B正确；C、复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此复性温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；D、DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率为14/16＝7/8，D错误。故选D。13．(1)溶解DNA二苯胺(2)序列数据库CaMV35S的引物设计不科学，原因是引物太短、特异性弱，并且两个引物之间会互补结合待测大豆基因组DNATaq（热稳定DNA聚合）4种脱氧核苷酸Taq酶活性较高引物与模板DNA的结合(3)琼脂糖凝胶电泳（或电泳）非转基因不可信的【分析】1、DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。2、PCR技术：概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。过程：高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；中温延伸：合成子链。【详解】（1）DNA不溶于水，不溶于酒精，但在2mol/LNaCl溶液中溶解度较高，故在研磨液中加入NaCl的目的是溶解DNA。提取到的DNA可以用二苯胺试剂鉴定。（2）①可从序列数据库中获取常见基因的信息，故在确定扩增对象后，从序列数据库中获得待扩增基因序列，以此为依据可设计引物。CaMV35S的引物设计不科学，原因是引物太短，有可能在模板上存在许多能结合的部位，特异性弱；并且两个引物之间不能有大量互补序列，否则复性时两种引物会结合，降低引物与模板结合的概率。②要测定某大豆基因组中是否有特定的基因，模板要选待测大豆基因组DNA。延伸是在Taq酶的作用下，以4种脱氧核苷酸为原料延伸子链，“延伸”的温度设定为72℃，是因为该温度下Taq酶活性较高。在设定的PCR体系下可以特异性扩增目标DNA片段，主要是因为加入了与特定部位结合的引物，引物可以通过碱基互补配对特异性结合到模板DNA的相应位置。（3）扩增产物DNA可采用琼脂糖凝胶电泳的方法鉴定。据图2初步判断，图中没有180的片段，因此该大豆并未扩增出NOS终止子，表明其基因组中没有NOS终止子，故为非转基因大豆。据图3分析，lectin是内源基因，每个大豆都应该有的基因，但是不仅待测样本没扩增出来，第2组普通大豆也没有扩增出来，表明实验的某环节出现问题。比如：提取DNA的环节并未提取到DNA，PCR环节并没有发挥扩增的作用等，故由于图3分析出的这些问题，图2的实验结果也不可信了。14．(1)信息传递吸烟者肺部细胞ACE2基因的表达显著增加,其肺部细胞膜表面ACE2比不吸烟者肺部细胞膜表面ACE2多(2)溶酶体(3)逆转录酶RNA需要DNA双链复制【分析】新型冠状病毒（COVID-19）是一种单股正链RNA病毒，病毒外有包膜，这层包膜主要来源于宿主细胞膜，包膜还含有病毒自身的糖蛋白，其中糖蛋白S可与人体细胞表面的ACE2蛋白结合，从而使病毒识别并侵入宿主细胞。【详解】（1）新冠病毒的糖蛋白S可与人体细胞表面的ACE2蛋白结合体现了膜的信息传递功能；吸烟更容易感染新冠病毒,可能的原因是吸烟者肺部细胞ACF2基因的表达显著增加,其肺部细胞膜表面ACE2比不吸烟者肺部细胞膜表面ACE2多。（2）溶酶体有多种水解酶，可将新冠病毒的包膜脱去；新冠病毒的遗传物质是RNA，据图分析新冠病毒增殖的过程中遗传信息的传递方向包括RNA的复制和翻译过程，故可表示如下：。（3）图丙中①过程是利用RNA逆转录得到DNA，因此需要逆转录酶催化；酶B能水解杂化双链中的RNA，酶C的作用类似于DNA聚合酶，起作用时需要以杂化双链中的DNA为模板合成互补子链；PCR是体外扩增DNA的过程，扩增过程的原理是DNA双链复制。15．(1)耐高温的DNA聚合酶（或Taq酶）将游离的脱氧核苷酸链接到引物的3′端(2)引物-2(3)适当降