脂肪酸合成酶（FAS）活性检测试剂盒实验解决方案

脂肪酸合成酶（FAS）活性检测试剂盒实验解决方案原理脂肪酸合成酶（FAS）是脂肪酸合成的关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。CheKine™脂肪酸合成酶（FAS）活性检测试剂盒（微量法）可检测生物体内FAS活性，其原理是：FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm光吸收下降速率，计算FAS活性。自备耗材·酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头·制冰机、低温离心机、水浴锅·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备ExtractionBuffer：即用型；用前一天取出置于4℃充分解冻后混匀，平衡到室温；-20℃保存。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。注意：AssayBuffer有一定的刺激性，建议在使用过程中做好个人防护。WorkingNADPH：临用前96T加入1.968mLAssayBuffer，48T加入0.984mLAssayBuffer，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存2周，禁止反复冻融。WorkingAcetylCoA：临用前96T加入0.528mLAssayBuffer，48T加入0.264mLAssayBuffer，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存2周，禁止反复冻融。WorkingMalonylCoA：临用前96T加入1.008mLAssayBuffer，48T加入0.504mLAssayBuffer，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存2周，禁止反复冻融。工作液的配制：每孔配制180µL工作液：吸取16µLWorkingNADPH，4µLWorkingAcetylCoA，8µLWorkingMalonylCoA和152µLAssayBuffer。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。1.动物组织：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心40min，取上清液，置冰上待测。2.植物组织：称取约0.1g样本，加入1mLExtractionBuffer捣碎，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），12,000g，4℃离心40min，取上清液，置冰上待测。3.细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗，离心后弃上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），12,000g，4℃离心40min，取上清液，置冰上待测。4.血清（浆）等液体样本：直接测定。注意：对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。紫外分光光度计用去离子水调零。2.恒温箱预热到37℃，工作液置于恒温箱中预热15min以上。3.在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入20μL样本和180μL工作液，迅速混匀，测定340nm处吸光值。记录第10s和70s时吸光值，分别记录为A1和A2。ΔA测=A1-A2。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.0005可适当加大样本量。如果ΔA大于0.4，样本可用ExtractionBuffer进一步稀释（计算结果乘以稀释倍数），或减少提取用样本量。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。A.使用96孔UV板测定的计算公式1.按照蛋白浓度计算活性单位定义：每mg蛋白每分钟氧化1nmolNADPH为1个酶活单位。FAS酶活(U/mgprot)=(ΔA测÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr×V样)÷T×n=3,216×ΔA测÷Cpr×n2.按照样本质量计算活性单位定义：每g组织每分钟氧化1nmolNADPH为1个酶活单位。FAS酶活(U/g鲜重)=(ΔA测÷ε÷d×V反总×109)÷(W×V样÷V样总)÷T×n=3,216×ΔA测÷W×n3.按细胞或细菌数量计算活性单位定义：每104个细胞或细菌每分钟氧化1nmolNADPH为1个酶活单位。FAS酶活(U/104)=(ΔA测÷ε÷d×V反总×109)÷(细胞或细菌数量×V样÷V样总)÷T×n=3,216×ΔA测÷500×n=6.432×ΔA测×n4.按液体体积计算活性单位定义：每mL样本每分钟氧化1nmolNADPH为1个酶活单位。FAS酶活(U/mL)=(ΔA测÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T×n=3,216×ΔA测×nε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，L，200μL=2×10-4L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V样：加入上清液体积，0.02mL；T：反应时间，1min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；V样总：提取液体积，1mL；500：细胞总数，500万。B.使用微量石英比色皿测定的计算公式将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。结果展示FAS(FAS(U/g)Figure1.小鼠脑、小鼠脾脏和玉米种子中的FAS活性。相关产品CatalogNo.ProductNameKTB2210Che