DNA的生物合成课件

DNA的生物合成(複製)DNABiosynthesis，Replication

CentralDogma描述遺傳資訊流動的方向1958年F.crick逆轉錄酶1970年對中心法則進行了補充

複製(replication)是指遺傳物質的傳代，以母鏈DNA為範本合成子鏈DNA的過程。複製親代DNA子代DNA第一節複製的基本規律BasicRulesofDNAReplication

一、半保留複製的實驗依據和意義子鏈繼承母鏈遺傳資訊的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式密度梯度實驗DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為範本(template)按堿基配對規律，合成與範本互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種複製方式稱為半保留複製。半保留複製的概念按半保留複製方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳資訊，體現了遺傳的保守性。半保留複製的意義遺傳的保守性，是物種穩定性的分子基礎，但不是絕對的。原核生物複製時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的複製叉，稱為雙向複製。二、雙向複製複製中的放射自顯影圖象A.環狀雙鏈DNA及複製起始點B.複製中的兩個複製叉C.複製接近終止點(termination,ter)oriterABC真核生物每個染色體有多個起始點，是多複製子的複製。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個複製子(replicon)。複製子是獨立完成複製的功能單位。真核生物5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’複製子3’三、複製的半不連續性3

5

3

5

解鏈方向3´5´3´3´5´領頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)順著解鏈方向生成的子鏈，複製是連續進行的，這股鏈稱為領頭鏈。另一股鏈因為複製的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續延長，這股不連續複製的鏈稱為隨從鏈。複製中的不連續片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領頭鏈連續複製而隨從鏈不連續複製，就是複製的半不連續性。

DNA複製的酶學TheEnzymologyofDNAReplication第二節參與DNA複製的物質底物(substrate):

dNTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol範本(template):

解開成單鏈的DNA母鏈(ssDNA）引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質因數一、複製的化學反應

(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

聚合反應的特點DNA新鏈生成需引物和範本；新鏈的延長只可沿5→3

方向進行。二、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)簡稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性5´

AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認錯配的堿基對，並將其水解。

核酸外切酶活性（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-pol

Ⅲ功能：對複製中的錯誤進行校讀，對複製和修復中出現的空隙進行填補。DNA-polⅠ（109kD）複製產生短片斷的DNA323個氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段604個氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實驗室合成DNA，進行分子生物學研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發生突變，細菌依然能存活。它參與DNA損傷的應急狀態修復。

功能是原核生物複製延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)複製產生長片斷的DNA（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引發，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的複製。在複製過程中起校讀、修復和填補缺口的作用。在線粒體DNA複製中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

三、複製保真性的酶學依據複製按照堿基配對規律進行，是遺傳資訊能準確傳代的基本原理。複製保真性的酶學機制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀

（二）複製的保真性和堿基選擇（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；並用其聚合活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，DNA-pol不表現活性。（二）複製的保真性和堿基選擇•DNA聚合酶靠其大分子結構協調非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。•

嘌呤的化學結構能形成順式和反式構型，與相應的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應處於反式構型。1.遵守嚴格的堿基配對規律；2.聚合酶在複製延長時對堿基的選擇功能；3.複製出錯時DNA-pol的及時校讀功能。DNA複製的保真性至少要依賴三種機制

四、複製中的分子解鏈及DNA分子拓撲學變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把DNA解成單鏈，它才能起範本作用。

（一）解螺旋酶和單鏈DNA結合蛋白

解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用於氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——複製起始時催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在複製中維持範本處於單鏈狀態並保護單鏈的完整108

局部解鏈（二）DNA拓撲異構酶(DNAtopoisomerase)

解鏈過程中正超螺旋的形成拓撲異構酶作用特點既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

拓撲異構酶Ⅰ

拓撲異構酶Ⅱ分類拓撲異構酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉不致打結；適當時候封閉切口，DNA變為鬆弛狀態。反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉使超螺旋鬆弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態。作用機制

五、DNA連接酶連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶在複製中起最後接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能（一）複製的起始需要解決兩個問題：1.DNA解開成單鏈，提供範本。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成

E.coli複製起始點oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯重複序列

反向重複序列5

3

5

3

1.DNA解鏈1）複製起始點的識別2）解螺旋酶解開雙鏈4）SSB參與維持DNA的單鏈結構的穩定3）DNA拓撲異構酶(可能主要是II型酶的作用)，在將要打結或已打結處作切口。

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓撲異構酶SSB3

5

3

5

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓撲異構酶引物酶SSB3

5

3

5

2.引發體的形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA複製起始區域的複合結構稱為引發體。

引物酶複製是在一段RNA引物的基礎上進行的，催化引物合成的是一種RNA聚合酶，它不同於催化轉錄過程的RNA聚合酶，因此稱為引物酶。

DDRP

——DNAdependentRNApolymerase由於DDDP不可以催化兩個單dNTP之間的反應，DDRP可以催化兩個NTP起始合成小的RNA片斷引物酶合成的小的RNA片斷稱為“引物”，為DNA的合成提供3’－OH3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶

複製開始後由於DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進行複製，在電子顯微鏡下均看到伸展成叉狀的複製現象，稱為複製叉。在DNA聚合酶III的作用下，新鏈第一個去氧核苷酸就加到引物的3’-OH末端上，形成磷酸二酯鍵。複製開始。（二）複製的延長複製的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol

領頭鏈的合成：DDDP沿著範本3’5’滑動，第一個進入配對的dNTP與RNA引物上的3’－OH形成3’,5’－磷酸二酯鍵，留下3’－OH繼續合成隨從鏈的合成——岡崎片段的形成

兩條鏈是在同一個DNA-polⅢ的催化下進行延長的過程階段一階段二階段三階段四原核生物基因是環狀DNA，雙向複製的複製片段在複製的終止點(ter)處匯合。oriterE.coli8232ori

terSV40500（三）複製的終止5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA連接酶

隨從鏈上不連續性片段的連接複製過程簡圖哺乳動物的細胞週期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

•

細胞能否分裂，決定於進入S期及M期這兩個關鍵點。G1→S及G2→M的調節，與蛋白激酶活性有關。•

蛋白激酶通過磷酸化啟動或抑制各種複製因數而實施調控作用。•

真核生物每個染色體有多個起始點，是多複製子複製。複製有時序性，即複製子以分組方式啟動而不是同步起動。•

複製的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和複製因數(replicationfactor,RF)。•

增殖細胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在複製起始和延長中起關鍵作用。（一）複製的起始3

5

5

3

領頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體（二）複製的延長染色體DNA呈線狀，複製在末端停止。複製中岡崎片段的連接，複製子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最後複製的RNA引物，去除後留下空隙。（三）複製的終止5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

端粒(telomere)是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結構部分，通常膨大成粒狀。結構特點•

由末端單鏈DNA序列和蛋白質構成。•

末端DNA序列是多次重複的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…功能•

維持染色體的穩定性•

維持DNA複製的完整性端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成端粒酶的催化延長作用爬行模型DNA聚合酶複製子鏈進一步加工

端粒維持著染色體的穩定。端粒因細胞分裂而變短到一定程度時，細胞就會死亡。端粒破損會導致DNA變得脆弱、容易發生變異，可能導致一些與衰老有關的疾病，如動脈硬化和某些癌症。

逆轉錄和其他複製方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四節逆轉錄酶(reversetranscriptase)逆轉錄(reversetranscription)RNADNA

逆轉錄酶一、逆轉錄病毒和逆轉錄酶

逆轉錄病毒細胞內的逆轉錄現象RNA範本逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA逆轉錄酶有三種酶的活性：RNA或DNA作範本的dNTP聚合酶活性和RNase活性

逆轉錄酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學研究可應用逆轉錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為範本，經逆轉錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。

試管內合成cDNAcDNA

complementaryDNARNA範本逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA整合宿主DNARNA病毒在細胞內複製成雙鏈的DNA，稱為前病毒，前病毒可以獨立繁殖在某些條件下，前病毒的基因組通過基因重組，參加到細胞基因組內，並且隨著宿主的基因一起複製和表達——整合前病毒獨立繁殖或者整合，都可成為致病的原因反轉錄病毒細胞內的複製二、逆轉錄研究的意義

逆轉錄酶和逆轉錄現象，是分子生物學研究中的重大發現。

逆轉錄現象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳資訊傳代與表達功能。對逆轉錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。

滾環複製(rollingcirclereplication)三、滾環複製和D環複製

是某些低等生物的複製形式，如X174和M13噬菌體等。3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滾環複製5'

5

3

3

5

dNTPDNA-pol

γ

D環複製(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的複製形式。

DNA損傷（突變）與修復DNADamage(Mutation)andRepair第五節遺傳物質的結構改變而引起的遺傳資訊改變，均可稱為突變。在複製過程中發生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水準來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。一、突變的意義（一）突變是進化、分化的分子基礎（二）突變導致基因型改變（三）突變導致死亡（四）突變是某些疾病的發病基礎

二、引發突變的因素物理因素:紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV紫外線照射可引起核酸鏈上相鄰的兩個胸腺嘧啶形成二聚體TT（胸腺二聚體）。化學因素三、突變的分子改變類型錯配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

DNA分子上的堿基錯配稱點突變(pointmutation)。發生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.轉換發生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換（一）錯配鐮形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

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pro·

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C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

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glu

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C肽鏈CTCGAG基因（二）缺失、插入和框移缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DN