肝纤维化的检测

肝纤维化检测及肝纤四项产品的应用Contents化学发光技术简介肝纤维化综述肝纤维化的检测措施血清学肝纤维化四项诊断的应用价值其他血清学检测指标简介肝纤维化诊断现实状况肝纤四项检测常见问题化学发光技术简介Part1.化学发光免疫分析技术概念化学发光免疫诊断技术是临床诊断领域最有前景的技术之一。其运用鲁米诺在酶促下发出的光子信号(以及其他发光方式)，放大抗原抗体反应，对体内的多种微量标志物进行检测，从而对多种疾病进行初期、特异和定量化的诊断。其特点在于敏捷度高、测定范围宽、迅速、简便，并且在测试中不使用有害的试剂，无污染。化学发光技术简介Part2.化学发光免疫分析技术的领先性放射免疫诊断技术（RIA）酶联免疫诊断技术（ELISA）化学发光免疫诊断技术（CLIA）20世纪60年代70年代80年代90年代2000年2020年时间临床免疫诊断技术的发展基本历经了如下三个阶段：化学发光技术简介化学发光技术简介Part3.化学发光免疫分析技术的优势1）敏捷度高敏捷度可达10-19mol/L以上。敏捷度(mol/L)10-2210-1810-1410-10酶标荧光放免发光化学发光技术简介2）线性范围宽发光强度与测定物质浓度间的线性关系达0～105范围。与酶标免疫的比色吸光度（OD值）0～3.0的范围相比，优势明显。例：CEA酶免只能到达80ng/ml；发光可以到达3000ng/ml。线性范围105104103102酶标荧光放免发光化学发光技术简介酶标荧光放免发光有效期（月试剂有效期长发光免疫的试剂有效期可长达1年。放射免疫由于放射性同位素衰变，一般有效期只有一种月，酶标免疫的底物稳定性差，有效期有限。化学发光技术简介4）安全性好：

消除了放射性污染，环境保护、安全。到目前为止，尚未发现化学发光免疫法的危害性。化学发光技术简介

化学发光（CLIA）酶免（EIA）放免（RIA）检测限（M/L）10-17-10-1910-1210-15标记物酶蛋白发光物质酶蛋白放射性元素灵敏度高低高线性范围宽窄宽放射污染无无有试剂稳定性6-12个月6-12个月1-3个月操作易易繁琐Part4.免疫分析技术对比（本章小结）肝纤维化（hepaticfibrosis）是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。是慢性肝病的共同病理学基础，伴随多种不一样的慢性肝脏疾病的进展可逐渐形成肝纤维化。轻―――肝纤维化重―――肝硬化（不一样之处――――肝小叶构造与否完整）引起肝纤维化的病因消除后――初期肝纤维化可完全恢复，肝硬化则不易复原。肝纤维化综述Part1.肝纤维化的概念肝纤维化严重时可引起门脉高压――纤维化组织压迫门静脉分支，门静脉阻力升高。从生理角度看，肝损伤时肝内纤维结缔组织增生是一种对损伤的正常修复反应。

肝小叶构造紊乱，肝细胞数量过度增生减少，肝功能减少

肝脏萎缩变硬，肝硬化失代偿肝纤维化是慢性肝病最重要的病理特性，也是慢性肝炎、肝硬化深入发展、恶化的重要原因。肝纤维化综述Part2.肝纤维化的病理生理学肝纤维化综述慢性乙型肝炎慢性丙型肝炎脂肪性肝炎（酒精或非酒精性）药物免疫性肝病胆汁淤积等肝纤维化综述Part3.肝纤维化的病因学过度纤维化会导致肝脏萎缩变硬，直到引起肝硬化或肝衰竭，进而导致患者完全丧失生活能力和死亡。据记录，目前我国乙肝病毒携带者1.2亿，慢性乙肝患者约3500万，加上慢性丙肝、脂肪肝、血吸虫病、免疫性肝病等，构成了庞大的潜在的肝纤维化患者群。调查显示，肝硬化占据国际上疾病死亡病因的第六位。初期发现并积极治疗肝纤维化，使之逆转或延缓其发展，对提高患者生活质量，改善患者预后，有十分重要的作用。肝纤维化综述Part4.肝纤维化的流行病学肝纤维化是肝硬化发展的必经阶段，多种原因导致的肝损伤，都可继发肝纤维化形成进而发展为肝硬化。初期肝纤维化可完全恢复，肝硬化则不易复原。肝纤维化综述Part5.小结肝活检病理学检查仍是诊断肝纤维化的金原则，是明确诊断、衡量炎症活动度、纤维化程度以及鉴定药物疗效的重要根据。目前一般采用半定量计分系统。不过，由于肝纤维化在肝内分布不均匀，并且肝穿刺组织仅占全肝的五万分之一，可导致诊断误差。因此强调肝活检标本至少15mm，并包括6个以上汇管区。Part1.病理学检查肝纤维化的检测措施肝纤维化的检测方法现代影像学手段如B型超声、CT、磁共振成像（MRI）等可以发现肝纤维化的某些征象，如肝脏轮廓、大小、及肝实质信号强弱的变化，肝脏血管内径及血流方向、速度的变化，脾脏大小的变化等。彩色多普勒超声检查或放射性核素扫描可以测定肝脏动脉和门脉的血流量及功能性门体分流状况。不过，目前这些影像学检查尚不能对纤维化做出确诊和鉴别诊断，更难于精确判断肝纤维化的严重程度，故只能作为一种辅助诊断。Part2.影像学检查肝纤维化的检测方法细胞外基质(ECM)及代谢产物ECM代谢有关酶类及克制剂胶原蛋白例如：PⅢNPPIPColⅣColVI非胶原糖蛋白例如：LNFNFNRUNTN糖胺多糖例如：HA蛋白多糖胶原酶及其克制剂例如：MMPsTIMPs脯氨酰羟化酶（PH）赖氨酰氧化酶细胞因子多肽类生长因子例如：TGF-β白细胞介素例如：IL-1肿瘤坏死因子例如：TNF-α干扰素例如：IFN-γPart3.血清学检查肝纤维化的检测方法Part4.不一样措施的对比肝纤维化的检测方法透明质酸（hyaluronicacid，HA）重要由纤维母细胞细胞合成，通过淋巴系统进入血循环，并由肝脏迅速清除。肝内皮细胞是HA摄取、降解的场所。由于体内存在有效的HA清除机制，正常人血清中仅有低水平的HA。多种原因导致的肝病可使血清HA水平上升，重要与肝脏清除功能下降、肝脏内成纤维细胞（肝星状细胞）合成增长有关。在肝纤维化时，肝星状细胞合成HA水平大大升高，且内皮细胞清除HA能力亦有下降，双重原因导致肝纤维化中HA水平上升。血清学肝纤维化四项诊断的应用价值Part1.透明质酸HA又称“小肝穿”，测定具有如下作用：1.反应肝脏纤维化形成；2.反应肝脏纤维化程度；3.反应肝细胞功能；4.反应肝脏炎症性病变；5.无论是无症状性病毒感染或严重病毒感染、酒精性肝病、胆汁性肝硬化，HA均是有效指标，可用于药物疗效观测及病情的动态观测。就目前临床研究而言：HA是目前众多纤维化生化指标中最为敏感和特异的指标（80%以上）。在慢性肝病肝纤维化组织学-血清对照研究中发现，HA是4项细胞外间质成分中最为敏感和特异的指标，HA的诊断精确性为82.9%，特异性为93%，敏感性为56%。血清学肝纤维化四项诊断的应用价值血清学肝纤维化四项诊断的应用价值Part2.层粘连蛋白层粘蛋白（laminin，LN）是基底膜成分中的重要大分子糖蛋白，在肝脏内与Ⅳ型胶原共同分布，大量沉积则引起肝窦毛细血管化，直接影响肝窦血流阻力。LN有十几种亚型，有报道显示肝纤维化过程中肝脏内大量合成β1和γ1链，有人研究老鼠肝纤维化时说大量合成的是2型而非1型。但到目前，在肝纤维化过程中研究最多的是1型。血清LN的测定一般是测定其LN-P1片断。LN-P1重要反应的是肝纤维化形成中的纤维化活性，其血清值被认为是反应基底膜更新率的指标，可提醒肝窦的毛细血管化和汇管区纤维化。LN在肝纤维化中的诊断价值：与肝纤维化形成的病因亲密有关，LN水平在酒精性肝硬化明显高于病毒性肝硬化和胆汁性肝硬化，LN水平可反应酒精性肝病与否存在门脉高压及门脉高压程度，但在非酒精性肝硬化，LN则不能用于门脉高压的诊断。目前，有关LN对诊断肝纤维化的价值仍有争议，其诊断敏感性不及ColⅣ和PⅢNP。血清学肝纤维化四项诊断的应用价值血清学肝纤维化四项诊断的应用价值PⅢNP是PCⅢ在细胞外形成原胶原前，被有关酶切下后进入血循环的氨基端尾肽。完整的PⅢNP重要通过窦状隙内皮细胞受体介导的内吞作用被清除，故胶原代谢活跃及肝功能损伤时，血清PⅢNP升高，PⅢNP被视为肝纤维化生成的血清学指标。Part3.Ⅲ型前胶原N端肽血清学肝纤维化四项诊断的应用价值PⅢNP的含量可以有效地区别轻型与中/重型慢性肝炎，提醒活动性肝纤维化，是反应慢性肝纤维化活动性和程度的指标。长期随访血清PⅢNP含量能鉴定慢性肝病的预后。对原发性胆汁性肝硬化、慢性迁延性肝炎、慢性活动性肝炎、自身免疫性肝炎进行2~随访，无论药物治疗与否，原发性肝硬化者血清PⅢNP总是升高，接受肝移植后恢复正常；慢性迁延性肝炎PⅢNP含量在正常上限；发展成肝硬化的慢性活动性肝炎其血清PⅢNP持续升高，转入缓和期则血清PⅢNP正常。唯自身免疫性肝炎例外，血清值一直不升高。血清PⅢNP可评估慢性肝病，尤其是慢性活动性肝炎纤维化过程，其临床判断预后价值已被公认，但总体敏感性、特异性不高。有报道，血清PⅢNP含量鉴别肝纤维化的敏感性和特异性分别是76%和71%。但PⅢNP正常或轻微升高不能排除已经存在但正在缓慢进展中的纤维化。此外，值得提出的是，在年幼的小朋友，生长导致全身间质胶原的更新可使血清PⅢNP水平明显升高，故对小朋友肝纤维化没有诊断价值。血清学肝纤维化四项诊断的应用价值血清学肝纤维化四项诊断的应用价值Ⅳ型胶原是构成基底膜的重要成分。肝纤维化时肝内Ⅳ型胶原合成增多并大量沉积，致使肝窦毛细血管化。Ⅳ型前胶原由氨基端三螺旋即7S胶原、羧基端球形区即NCl及主三螺旋区构成。在血清中可出现这三种重要的降解片断，3者均是反应Ⅳ型胶原降解的指标，即具有相似的临床意义，差异在于不一样成分的检测敏感度不一样。由于胶原降解的增长常伴有更多的再合成，因此，确切地说，它们是反应基底膜胶原更新的指标。Part4.Ⅳ型胶原研究表明，Ⅳ型胶原成分的检测对判断肝纤维化和肝硬化具有较高的敏感性（79%）和特异性（82%）。有文献报道在慢性活动性丙肝患者中组合运用Ⅳ型胶原与凝血酶原时间（PT)可明确地诊断为肝硬化。血清学肝纤维化四项诊断的应用价值血清甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合二次的结合型胆酸之一，在肝细胞内，胆固醇通过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸（CD-CA）。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12），侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合，分子量为462u。

CG正常代谢途径为肠—肝循环，CG由肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，协助食物消化。95%胆酸在回肠末端重吸取，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再运用。在血清中重要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量不不小于1%。在正常状况下,外周血中胆酸含量甚微,正常成人无论空腹或餐后,其血清CG浓度稳定在低水平。其他血清学指标简介Part1.甘胆酸其他血清学指标简介当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，用RIA（radioimmunoassay放射免疫测定法）法检测血清甘胆酸（SCG）是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。临床意义

（1）急性肝炎、慢性活动性肝炎、原发性肝癌、肝硬化、慢迁肝患者血CG均明显高于正常人，且呈递性增高。

（2）胆石症伴黄疸患者胆管、胆囊排泄功能障碍引起血清CG明显升高。

（3）肝硬化、梗阻性肝病、肠—肝循环障碍血清CG水平高于正常人。Part2.纤维连接蛋白及其受体纤维连接蛋白(FN)及其受体(FNR)：FN在体内有2种形式，即细胞型和血浆型。血浆型FN绝大部分由肝细胞合成。在肝脏，FN与胶原、LN等共同构成基底膜成分。肝纤维化及肝硬化时，肝组织中细胞型FN含量明显增长，但血浆FN水平则明显减少，后者反应了肝细胞合成蛋白质功能的减退。故血清FN对肝纤维化的判断价值尚不能一定。运用ELISA法研究慢性肝病病人血清FNR(FN受体B亚单位)，发现慢性活动性肝炎、肝硬化、酒精性肝病和肝细胞癌病人血清FNR水平明显升高，并与血清PⅢNP水平有关；血清FNR水平与组织学肝纤维化程度的有关性，比与组织学上坏死、炎症的有关性更为亲密，而血清PⅢNP则相反。表明血清FNR在反应肝纤维化方面优于血清PⅢNP，认为其是反应肝纤维化的1种有价值的指标.其他血清学指标简介Part3.Ⅰ型前胶原羧基端肽和氨基端肽Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)和氨基端肽(PⅠNP)：Ⅰ型胶原的生物合成过程与Ⅲ型胶原不一样的是，Ⅰ型前胶原形成原胶原过程中，其PⅠCP被完全切除。因此，理论上讲，PⅠCP可直接反应胶原生成。然而，研究表明，血清PⅠCP对区别酒精性肝炎和酒精性脂肪肝的精确性不如血清PⅢNP；血吸虫病患者初期血清PⅠCP增高的幅度不小于晚期，而晚期患者血清PⅢNP仍持续增高；肝外间质组织(如骨、皮肤)富含Ⅰ型胶原，在生长年龄对血清含量影响较大，故目前已较少采用。血清PⅠNP检测的意义和价值与PⅠCP相似。其他血清学指标简介肝纤维化的诊断依赖于肝活检病理诊断，这种创伤性检查具有许多明显局限性，如具有创伤性、难以反复活检、有一定的并发症（1/3的患者有疼痛；0.3％的患者出现严重并发症，包括出血，气胸，结肠和胆囊穿孔等；尚有0.03％的死亡率）、病变在肝脏内不均匀、存在观测者自身和观测者之间的差异（半定量分期系统可误差1-2期）、标本长度不够（长度<20mm和<10个汇管区）等易出现低估以及标本破碎及肝包膜下纤维化可导致假象。因此临床上迫切需要寻找简朴、易推广的非创伤性诊断措施来诊断和评估肝纤维化。数年来，人们一直在试图寻找无创的血清学指标来评估慢性肝病的肝纤维化，包括常规生化、纤维化、细胞因子、免疫功能等，但迄今为止，还没有任何单项指标能足够敏感、精确地反应肝纤维化程度。近十数年来，国外建立了多种以综合多项临床、生化指标及影像学为基础的肝纤维化非创伤性诊断预测模型。目前公认的是这四项：HA、LN、PⅢNP、CⅣ。诊断肝纤的敏捷度为60-70%，特异性为90%以上。肝纤维化诊断现实状况肝纤四项检测常见问题问题一：肝纤维化血清学检测有什么临床意义？解释：肝纤维化检测的措施常规的有三种，即病理学检测、影像学检测和血清学检测。目前，病理学检测仍然是肝纤维化检测的“金原则”，而影像学和血清学作为辅助诊断的项目。虽然病理学检测的承认度最高，不过由于具有创伤性，并且技术难度和风险度都很高而致使其应用受到限制，尤其是不可以监测患者的病情。影像学的发展对肝纤维化的诊治非常地故意义，不过目前市场上产品的辨别率普遍偏低，这对初期肝纤维化的发现和诊治失去价值，从而使病人失去肝纤维化治疗的宝贵时间。血清学检测则是对病理学检测和影像学检测最有效的补充，不仅可以监测病人病情，并且对初期肝纤维化的发现和治疗非常有价值。肝纤四项检测常见问题问题二：肝纤维化检测的血清学指标非常多，为何国内多采用透明质酸、层粘连蛋白、Ⅲ型前胶原N端肽和Ⅳ型胶原联合检测来诊断肝纤维化？解释：尽管肝纤维化发生时，许多血清学指标也许都会升高，不过目前在血清学检测肝纤维化领域，还没有任何单项指标具有较高的敏感度和特异性，单项检测的意义也需要结合患者自身的其他状况综合分析。因此目前研究者都在寻求最佳的检测指标组合模式以提高检测的敏感度和特异性。不过由于肝纤维化的病因诸多，学术方面还没有找到适合所有肝纤维化病因的血清学指标组合方案。肝纤维化四项产品是针对国内患者人群的现实状况开发出的具有相对较高临床敏感度和临床特异性的产品。问题三：肝纤维化四项检测的应用范围有哪些？解释：重要合用于：1）门诊上肝病病人的常规检查，如慢性乙肝患者、脂肪肝患者（包括酒精肝患者）、慢性丙肝患者等等；2）临床上对病人病情的监测及对病人治疗效果的观测。3）抗纤维化药物的临床研究。例如森隆药业的药物安络化纤宣传资料上就推荐使用“小肝穿”的HA判断肝纤维化的程度和观测药物的疗效。肝纤四项检测常见问题问题四：为何肝纤维化四项有些项目测定值非常高，而其他几项指标正常？解释：肝纤维化四项检测在国内由来已久，虽然是国内公认的检测肝纤维化比较敏感和特异的血清学指标，不过单个项目检测肝纤维化的敏感度和特异性却有很大差异。重要有两个原因：1）肝纤维化的病因不一样导致的差异；2）肝纤维化发展为不一样步期导致的差异。目前对于这个问题学术还没有非常详尽的解释，对于第二种原因我们通过某些临床试验发现四项指标都高的多是肝硬化、重肝和肝癌病人；在肝纤维化初期透明质酸和Ⅲ型前胶原N端肽的敏感度更高；肝纤维化发展为肝硬化前的中晚期时层粘连蛋白和Ⅳ型胶原迅速升高；而处在治疗阶段的病人伴随病情的好转某些指标会转为正常，尤其是透明质酸和Ⅲ型前胶原N端肽，它们对于肝纤维化病情的监测效果更佳。需要提起注意的是：四项指标检测肝纤维化没有固定的模式，因病因、因病情、因病人会有差异，需要结合单个项目的临床意义和病人的其他检测指标及有关症状分析病人病情，只通过成果的阴阳性鉴定肝纤维化是不科学的。肝纤四项检测常见问题问题五：问什么层粘连蛋白和Ⅳ型胶原采用夹心两步法？解释：LN系生物大分子，不仅存在二十种左右的亚型，并且在血清内被降解至少7个片段以上，理论上无法对其进行最精确的定量。由于这个原因，竞争法测定期，由于抗原降解时片段增多，而抗原位阻减小，从而导致成果大大偏高（如放免类试剂），夹心一步法测定成果则由于片段干扰标识抗体结合在固相上而导致不一样程度地偏低，可以说有关性很差，我们在研发过程中发现某些重症肝硬化患者一步法测定成果整体偏低证明这个现象，这样的成果一定无法应用于病情监测。而我们最终确定的两步法模式，则最大程度克服了这个问题，使测定成果和病人病情有很高的有关性，从而可以应用于病情的监测。在最初研究CⅣ项目时，曾发现血清稀释一倍后，发光值成更大比例地减少，通过查阅文献，推测血清内应存在大量的单体形式或降解形式，由于只有这样，才会导致测定成果受到极大的干扰。因此，采用竞争法和夹心一步法测定CⅣ，成果一定不精确。我们采用两步法操作，斜率在1左右，最大程度消除了单体及降解片段的干扰，成果更可信，对于患者的病情监测更故意义。肝纤四项检测常见问题问题六：肝纤维化四项操作时要尤其注意的问题有哪些？会导致什么后果？解释：操作时需要尤其注意的问题有：1）所有项目尽量减小加样误差，提议采用贴壁的加样措施，为了防止HA和PⅢNP产品加样时污染，可采用加标本时贴微孔下壁，加HA结合蛋白溶液或PⅢNP抗体溶液时贴微孔上壁的措施，或者加完标本时把板子水平转动180度再加HA结合蛋白溶液或PⅢNP抗体溶液。当加样不准时会导致误差加大，污染则导致测定错误。2）温育时使用水浴最佳，也可采用在水浴锅内放入试管架或医用托盘，上面铺上湿纱布，反应时将板子放在纱布上的做法，还可以采用在温箱中放入铺有湿纱布的医用托盘的做法。以上提议的温育措施重要是为了消除边缘效应，提高测定的精确性，使可反复性增强。假如直接把微孔板放在铁架子上，会使边缘微孔受热过快，发光值偏高