人胃肠癌类器官药物敏感性测试管理规范

I人胃肠癌类器官药物敏感性测试管理规范范围本文件规定了人胃肠癌患者来源的肿瘤类器官的伦理、技术和管理等要求。本文件适用于人胃肠癌患者来源的肿瘤类器官药物敏感性测试的操作规范、流程管理和使用指引。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T37864生物样本库质量和能力通用要求WS213丙型肝炎诊断WS293艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准WS299乙型病毒性肝炎诊断标准类器官药物敏感性检测指导肿瘤精准治疗临床应用专家共识(2022年版)肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识(2022年版)中华人民共和国药典（2020年版）全国临床检验操作规程涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法（2023年版）术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1类器官organoids由干细胞或前体细胞体外培养形成的，包含组织器官特异性的多种细胞，能自我更新，具有特定器官关键结构和功能特性的三维（3D）细胞培养物。3.2肿瘤类器官tumoroids由患者的肿瘤组织或其他含肿瘤细胞的样本中提取的肿瘤细胞经体外培养而成的，可以在体外扩增并重现原始肿瘤病理形态、遗传特征和治疗反应特征的类器官。3.3人胃癌类器官humangastriccancerorganoids由病理诊断为胃癌患者的胃肿瘤细胞培养而成的具有胃癌特征的肿瘤类器官。3.4人肠癌类器官humanintestinalcancerorganoids由病理诊断为肠癌患者的肠肿瘤细胞培养而成的具有肠癌特征的肿瘤类器官。3.5类器官传代organoidpassage体外培养的类器官经过物理、化学或生物等处理方法，将原有类器官分成更小细胞簇甚至是单细胞，重新接种到与原培养条件相同的新培养体系中进行体外培养的过程。3.6类器官冻存organoidcryopreservation类器官暂时脱离生长状态并保持其细胞组成、基因表达特征及功能特性的低温冷冻过程。3.7类器官复苏organoidthawing冻存的类器官重新获得生长和代谢活力的过程。3.8类器官药物敏感性测试Organoidsdrugsensitivitytesting将多种药物组合或单独的药物作用于类器官进行药效、毒性评估的过程，简称类器官药敏测试。缩略语下列缩略语适用于本文件。DAB：二氨基联苯胺（Diaminobenzidine）DMSO：二甲基亚砜（DimethylSulfoxide）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）H&E：苏木精-伊红（HematoxylinandEosin）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSaline）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）STR：短串联重复序列（ShortTandemRepeat）伦理要求5.1人胃癌和人肠癌类器官的伦理审查要求依照国家卫生健康委、教育部、科技部、国家中医药局发布的《涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法》（2023年版）进行审查。5.2应与类器官原组织供者签署书面的合法有效的知情同意通知书，包括但不限于：合适条件下潜在研究及治疗的应用、研究成果潜在的商业应用及其他问题所适用的内容。应对类器官原组织供者个人信息进行隐私保护。5.3人胃癌和肠癌组织的采集、人胃癌和肠癌类器官的生产，以及利用人胃癌和肠癌类器官开展科学研究、产品开发、临床药敏测试等相关活动均需经过伦理审查委员会审查通过。类器官要求6.1形态学特征人胃癌类器官在光学显微镜下呈现囊泡型、致密型或混合型等多种形态特征；人肠癌类器官在光学显微镜下应边缘清晰、透亮，由细胞簇组合而成，呈现致密型、松散型、囊泡型或混合型等形态特征。体外三维培养类器官，可使用光学显微镜观察，光学显微镜的倍数参照类器官的直径大小选择。6.2组织病理学特征类器官中的细胞应与原肿瘤组织中肿瘤细胞的异型性特征保持一致，如核深染、异常核分裂象、核质比失调等。应对类器官进行相关标志物检测，检测结果应与原肿瘤组织结果基本一致，一致性不低于50%。人胃癌类器官检测的标志物包括但不限于CEA、CA19-9和Ki67，人肠癌类器官检测的标志物包括但不限于CDX2、CK20、CK7和Ki67。可按照附录A检测。6.3基因遗传特征应对类器官进行基因变异检测，检测结果应与原肿瘤组织的基因变异结果基本一致。人胃癌类器官和人肠癌类器官应检测的肿瘤相关热点基因包括但不限于TP53、KRAS、NRAS、ERBB2、BRAF、NTRK1、ARID1、ARBB2、MUC6、RHOA、RNF43、APC、SMAD4、CDH1和PIK3CA。可按照附录B检测。体外生长特征从胃、肠癌患者来源的人胃、肠癌组织或细胞，初次在体外培养成人胃肠癌类器官后，应能在体外维持培养2个月，或应能传代至少3代，且类器官数量应保持稳定。当类器官传代后，应能体外重新生长成为新的类器官，重新生长的类器官和传代前类器官的形态学特征、组织病理学特征和遗传特征应保持一致。存活率复苏的类器官存活率应不低于50%。可按照附录C检测。6.6微生物支原体、细菌、真菌、HIV、HBV、HCV、外源病毒因子等应为阴性。支原体按照《中华人民共和国药典》（2020年版）中“3301支原体检查法”检测。细菌及真菌按照《中华人民共和国药典》（2020年版）中“1101无菌检查法”检测。HIV按照WS293核酸法检测。HBV按照WS299核酸法检测。HCV按照WS213核酸法检验。外源病毒因子按照《中华人民共和国药典》（2020年版）中“3302外源病毒因子检查法”检测。体外培养的类器官，进行STR检测及分型鉴定，应与供体STR一致。可按照附录D检测。成瘤性当人胃肠癌类器官通过体内异种移植的方式接种于免疫缺陷小鼠后，应能形成肿瘤。可按照附录E检测。类器官管理要求标识应建立培养、验证、记录和维护等相关人胃肠癌类器官的规程。应建立人胃肠癌类器官的唯一标识。此唯一标识应至少包括类器官名称、样品编号或批号，应有与供者相关的信息代码。应记录人胃肠癌类器官培养信息，包括但不限于培养时间、培养人员、培养方法、类器官名称等。冻存应建立人胃肠癌类器官冻存规范。冻存过程应控制细胞密度、细胞活率、冷冻速率等，并选择使用适当的冷冻保护剂，并对冷冻过程进行记录，包括但不限于：类器官名称、批号、代数、冻存日期、冻存人员、类器官数量等。应按照GB/T37864要求对人胃肠癌类器官进行储存。应对每批储存的人胃肠癌类器官进行记录，记录内容包括但不限于：类器官名称、批号、储存日期、储存位置和存储数量等。7.3运输供应方应制定人胃肠癌类器官运输规程并实施。应按照GB/T37864要求进行运输，并根据人胃肠癌类器官的使用需求选择适当的运输方式和运输条件。人胃肠癌类器官应以冻存状态或以生长状态的方式运输，根据规程控制运输条件包括但不限于：温度、防污染措施、适当的包装等，并告知接收方相关信息。人胃肠癌类器官的运输应记录以下方面，包括但不限于：运输方式和条件、运输路线、联系方式和收件人信息等。应在必要时检查运输中的包裹，并在可能的情况下添加新的冷冻源（如干冰和液氮）以保持适宜的运输温度。7.4使用说明应按照GB/T37864要求进行人胃肠癌类器官分发。使用前，应由人胃肠癌类器官接收方提交申请，并经供应方根据其正式程序进行审批。供应方与用户签署MTA或同等条款和条件文件。供应方应向用户提供相关信息包括但不限于：可追溯的批号、质量证明、培养方法、冻存方法、冻存日期、建库日期、微生物检测数据、匿名化的类器官供者的知情同意书副本等。类器官药敏测试8.1药物板应建立人胃肠癌类器官药物板的管理规范，包括但不限于：药物配制时间、药物配制人员、取用记录和药物板维护等相关类器官药物筛选的规程。应建立人胃肠癌类器官药物板的详细标识，此标识表包括但不限于药物名称、药物位置、药物浓度范围、药物体积、配制日期、有效期记录、配制人员等。应结合药物种类、药物溶剂、药物的有效储存条件等选择合适的药物储存条件，存储条件控制内容包括但不限于：存储温度、防污染措施、封膜处理等，并记录相应储存条件下药物的有效期、储存日期、储存位置等信息。且应对每批储存的药物板进行记录，记录内容包括但不限于：药物板名称、药物数目、药物批号等。供应方应制定人胃肠癌类器官药物板的运输规程并实施。根据药物板的使用需求选择适当的运输方式和运输条件，必要时检查运输中的包裹，并在可能的情况下添加新的冷冻源以保持适宜的运输温度。且应记录药物板运输记录，包括但不限于：运输方式和条件、运输路线、联系方式和收件人信息等。8.2类器官用于临床药敏测试的人胃肠癌类器官应符合第6章的技术要求，且类器官代数应不超过20。8.3操作流程8.3.1仪器和设备准备：微孔板、移液工作站/自动分液器、自动微量加样器、化学发光细胞活性分析系统。8.3.2试剂准备：基质胶、人胃肠癌类器官培养基、药物板、ATP活性检测试剂、Staurosporine、蛋白酶抑制剂Mg132。8.3.3检测步骤8.3.3.1收集数目合适且生长状态良好的人胃肠癌类器官，用PBS洗去基质胶后，离心收集类器官。8.3.3.2采用机械或酶解法消化人胃肠癌类器官成单细胞，用预混5%～50%基质胶的人胃肠癌类器官培养基重悬细胞或用基质胶预先包被板底后铺入单细胞悬液。使用自动分液器将单细胞混液按合适数目进行铺板，孔间细胞密度要求一致。8.3.3.3根据药物的有效抑制浓度范围合理设计药物工作剂量梯度，并预设好药物板上各药物的位置及浓度分布孔位。按药物说明书选择合适溶剂溶解药物配成合适的储液浓度，将储液药物依次稀释到相应的工作剂量浓度并移至对应的药物板空位。8.3.4药物处理8.3.4.1提前设置好药物处理分组，阴性对照组、药物处理组和阳性对照组。8.3.4.2提前预设好人胃肠癌类器官单细胞板上药物处理的组别、浓度和加样位置。8.3.4.3在药物处理前后观察且记录类器官的生长特征，用微量加样器将药物板上对应的药液按相应浓度移至上述细胞板位置。8.3.5细胞活性检测8.3.5.1按ATP化学发光检测试剂盒说明书对细胞活性进行检测。8.3.5.2使用化学发光细胞活性检测仪对加入细胞活性ATP检测试剂的细胞进行检测，得到各实验药物组细胞RLU数值并分析上述各组的细胞活性变化。8.3.6结果分析与判读8.3.6.1药物溶剂和空白组为阴性对照组，药物处理组为各浓度梯度的药物，蛋白酶抑制剂Mg132或Staurosporine处理组为阳性对照组。阴性对照组细胞活性应最强。8.3.6.2类器官细胞活性按照公式（F.1）进行计算：CV=（CV药物/CV对照）×100%（F.1）式中：CV—类器官细胞相对活力；CV药物—药物处理组类器官细胞活力；CV对照—阴性对照组类器官细胞活力。8.3.7计算与分析按上式计算各药物浓度剂量下的细胞活力，保证至少三次技术重复，结合药物浓度，绘制剂量反应曲线，得出IC50。8.3.8结果判读类器官药物反应结果与临床疗效的一致性比较依照共识进行判读。8.4流程管理应记录人胃肠癌类器官药物筛选信息，包括但不限于类器官名称、类器官代数、类器官的数目、测试药物名称、测试药物数目、药物筛选人员等。应建立人胃肠癌类器官药敏测试实验规范，应按照《肿瘤类器官诊治平台的质控标准中国专家共识（2022年版）》和《类器官药物敏感性测试指导肿瘤精准治疗临床应用专家共识（2022年版）》（以下简称“共识”）要求进行药敏测试，包括但不限于：患者知情同意授权、入组患者人群、药物测试选择、药物测试结果判读、患者个性化治疗方案选择等。应按照共识要求记录人胃肠癌类器官药敏实验，记录内容包括但不限于：人胃肠癌组织原代处理图片、类器官培养成功图片、类器官的数目/直径变化、用药前后类器官的形态学变化、药物剂量变化曲线、细胞活力量化结果统计等。应按照共识要求在具有测试资质的医疗机构或第三方检测单位进行药敏实验，测试结束后应对实验结果出具测试报告，报告内容包括但不限于肿瘤生长抑制率、半数抑制浓度、二分类法或三分类法区分出药物抑制效果等。由于胃、肠肿瘤的复杂性，应按照共识要求在临床诊疗过程中进行多学科讨论，依据患者具体病情、病理结果及患者原始癌组织的基因测试结果综合判断胃癌或肠癌类器官药敏报告，为患者制定安全、潜在获益的单药、联合用药策略。

附录A（资料性）类器官组织病理检测石蜡包埋法A.1仪器和设备石蜡包埋仪、石蜡切片机、组织摊片机、光学显微镜。A.2试剂A.2.1石蜡切片制备试剂：按照相应要求配制石蜡包埋需要试剂，包括固定液、脱水液、石蜡、脱蜡液、复水液、乙醇、二甲苯、中性树脂。A.2.2H&E染色试剂：苏木精、伊红。A.2.3除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。A.3检测步骤A.3.1样品准备和固定取体外培养的类器官，用移液器吸出类器官和基质胶混合物，转移至15mL离心管内，离心弃上清，用4%多聚甲醛固定类器官15min-30min。A.3.2类器官石蜡切片制作按照石蜡切片制作方法对类器官样品进行固定，脱水，透明后浸入石蜡中，用石蜡包埋仪器进行包埋。用石蜡切片机切成标准厚度，制成石蜡切片。A.3.3H&E染色将类器官石蜡切片进行脱蜡，复水，用苏木精染色，分化后冲水。接着用伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。A.3.4免疫组化染色将类器官石蜡切片进行脱蜡，复水，抗原修复，加封闭液进行封闭。加一抗孵育，PBS清洗。加对应二抗，PBS清洗。用DAB进行显色，加水终止显色反应。苏木精衬染，盐酸透明后冲水。乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。A.4结果分析得到的检测结果由具有病理诊断资质的人员分析和判定，并与原肿瘤组织病理检测结果具有一致性。

附录B（资料性）类器官基因突变检测测序法B.1仪器和设备离心机、-80℃冰箱、超微量分光光度计。B.2试剂按相应要求准备的细胞DNA抽提试剂盒。B.3样品保存样品制备好后，于-80℃以下保存。B.4检测步骤B.4.1样品制备将类器官在基质胶中培养至稳定生长状态，用移液器吹打基质胶，至基质胶破碎后，混合液收集于离心管中，离心收集类器官，弃上清。B.4.2DNA提取按细胞DNA抽提试剂盒说明书对类器官基因组DNA进行提取，提取后的DNA使用超微量分光光度计进行浓度和质量检测。B.4.3测序将类器官DNA样本和原肿瘤组织送至具有临床基因检测资质的机构进行一代测序或二代测序检测，或采用ARMS法、ddPCR法等对基因位点进行检测。B.5结果分析分析基因突变位点，比较类器官测序和原肿瘤组织测序结果的一致性。

附录C（资料性）类器官存活率检测钙黄绿素AM染色法C.1仪器和设备倒置荧光显微镜、光学显微镜、细胞培养箱。C.2试剂C.2.1细胞级别DMSO。C.2.2PBS（pH为7.4）。C.2.3储存液的配制（钙黄绿素AM溶液）：用细胞级别DMSO制备2mmol/L的钙黄绿AM素溶液。C.2.4除特别说明外，所用试剂均为分析纯，检测用水均为去离子水。C.3检测步骤C.3.1类器官总数量计数将体外培养的类器官置于光学显微镜下，观察其形态和状态，通过肉眼观察来确定类器官是否存活。C.3.2活类器官数量计数实验时，取出已经配置好的钙黄绿素AM储存液，加入钙黄绿素AM溶液到培养基中至终浓度为0.2μmol/L。随后在37℃条件下孵育60min。到达时间后，用PBS缓慢清洗掉带有钙黄绿素AM的培养基，加入新鲜培养基。用490nm激发波长，515nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察类器官并断层扫描拍照。活类器官在荧光显微镜下显示为绿色且边缘清晰。对直径≥20μm的活类器官计数。C.4类器官存活率计算符合6.1类器官形态要求，对直径≥20μm的类器官计数。类器官存活率按照公式（C.1）进行计算：X=（N活/N总）×100%（C.1）式中：X—类器官存活率；N活—活类器官数量；N总—总类器官数量。C.5计算与分析按照C.3步骤再重复两次，计算三次活类器官比率结果的平均值，记为类器官平均存活率。C.6精密度在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。 

附录D（资料性）类器官STR鉴定D.1仪器和设备离心机、PCR仪、毛细管电泳仪、微量紫外分光光度计、-80℃冰箱。D.2试剂细胞DNA抽提试剂盒、STR细胞鉴定试剂盒。D.3样品保存样品制备好后，于-80℃以下保存。D.4检测步骤D.4.1样品制备将类器官在基质胶中培养至稳定生长状态，用移液器吹打基质胶，至基质胶破碎后，混合液收集于离心管中，离心收集类器官，弃上清。D.4.2DNA提取D.4.2.1按细胞DNA抽提试剂盒说明书对类器官和原肿瘤组织基因组DNA进行提取；D.4.2.2紫外分光光度计检测提取后的DNA的吸光度A260/A280的比值在1.8~2.0之间；D.4.2.3DNA样本要求：DNA体积≥20μL，浓度≥50ng/μL。D.4.3PCR扩增D.4.4.1按照标准PCR扩增方法对STR位点进行扩增，也可以按照经过质检合格的商业化试剂盒说明书进行。D.4.4.2设置阴性对照组、样本检测组和阳性对照组。阴性对照组采用无菌水为模板进行PCR扩增，样本检测组以类器官和原肿瘤组织样本提取的DNA为模板进行PCR扩增，阳性对照组采用DNA模板进行扩增。D.4.4.3采用琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物、阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组无目的条带，阳性对照组有清晰的目的条带。D.4.4STR基因分型检测使用毛细管电泳基因分析仪对PCR扩增产物进行检测，并得到STR遗传图谱数据。阳性对照组有清晰的目的条带。类器官与原肿瘤组织的扩增条带应该一致。D.5结果分析D.5.1当STR位点的等位基因含有相同重复次数时，图谱仅出现1个等位基因峰；当含有不同重复次数时，图谱会出现2个等位基因峰。且当阴性对照组无等位基因峰出现，阳性对照组检测结果与其标准基因分型数据一致时视为有效检测。D.5.2在检测有效的前提下，若受检样本STR位点出现2个以上的等位基因峰，经过重复实验排除引物结合区突变等干扰因素后，判定受检样本存在交叉污染。 

附录E(资料性)成瘤性检测人胃肠癌类器官皮下成瘤实验E.1仪器和设备接种针、游标卡尺、体重秤、4℃冰箱。E.2试剂基质胶。E.3实验动物NSG（NODscidgamma）或NCG（NODCRISPRPrkdcIl2rgamma）免疫缺陷小鼠，4-6周鼠龄。E.4检测步骤E.4.1样本制备收集生长状态良好且数量合适的人胃肠癌类器官，并通过50%基质胶进行重悬，置于4℃备用。E.4.2皮下移植用接种针将人胃肠癌类器官注射到周龄为4-6周的免疫缺陷小鼠皮下，每个类器官样本需要保证至少两个生物学重复，并在注射后观察和记录小鼠皮下肿瘤的生长情况。E.4.3皮下肿瘤收集对皮下肿瘤进行收集，记录并拍照。E.5结果分析E.5.1皮下肿瘤大小计算E.5.1.1皮下肿瘤体积计算皮下肿瘤体积按照公式（E.1）进行计算：V（cm3）=1/2×长径×短径2（E.1）式中：V—肿瘤体积；长径—肿块最长两点的距离短径—肿块最短两点的距离。E.5.1.2计算与分析计算多次肿瘤大小结果的平均值，记为肿块的大小。E.5.2皮下肿瘤组织病理学检测按照附录A检测。参 考 文 献[1]国家卫生计生委.涉及人的生物医学研究理论审查办法，2016[2]科技教育司-国卫科教.涉及人的生命科学和医学研究伦理审查办法，2023[3]GB/T37864-2019生物样本库质量和能力通用要求[4]GB/T42466-2023生物样本库多能干细胞管理技术规范[5]T/CSCB0001-2020干细胞通用要求[6]T/CSCB0005-2022人肠道类器官[7]T/CSCB0006-2022人肠癌类器官[8]T/CSCB0009-2022人干细胞研究伦理审查技术规范[9]中国临床肿瘤学会指南工作委员会.中国临床肿瘤学会(CSCO)胃癌诊疗指南2023[M].北京:人民卫生出版社,2023.[10]中国抗癌协会肿瘤多学科诊疗专业委员会,中国抗癌协会肿瘤内分泌专业委员会.肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识（2022年版）[J].中国癌症杂志,2022,32(07):657-668.[11]类器官药物敏感性检测指导肿瘤精准治疗临床应用专家共识(2022年版)[J].中国癌症防治杂志,2022,14(03):234-239.[12]中华人民共和国药典（2020年版）[13]CancerGenomeAtlasResearch,N.(2014).Comprehensivemolecularcharacterizationofgastricadenocarcinoma.Nature513,202-209.[14]Yan,H.H.N.,etal.(2018).AComprehensiveHumanGastricCancerOrganoidBiobankCapturesTumorSubtypeHeterogeneityandEnablesTherapeuticScreening.CellStemCell23,882-897e811.[15]LinH,WangY,ChengC,QianY,HaoJ,ZhangZ,ShengW,SongL,DengCX,ZhaoB,CaoJ,WangL,WangL,LiangL,ChenWK,YuC,SunZ,YangY,WangC,ZhangY,LiQ,LiK,MaA#,ZhaoT#,ChenYG#,HuaG#.2023Standard:Humanintestinalcancerorganoids.CellRegeneration,12(1):24.doi:10.1186/s13619-023-00167-6.PMID:37378693(Editorial).[16]WangY,LinH,ZhaoL,HongF,HaoJ,ZhangZ,ShengW,S