HIFU的免疫调控作用

高能量聚焦超声（HIFU）的免疫调控机理聚焦超声是一种正在受到世界各国广泛重视的无创局部治疗手段HIFU：High-IntensityFocusedUltrasoundHIFU技术的产业转化：涉及物理学、生物学、医学、机械工程学、电子学、计算机科学、材料科学以及传热学等多种学科，融合了包括传感器技术、信号处理技术、水处理技术、生物工程技术、图像处理、肿瘤组织变性鉴别技术及计算机辅助设计、计算机治疗计划系统等最新研究成果。HIFU作为肿瘤治疗的新技术尤其引起了越来越多的关注国内外对HIFU已进行了近十年的研究，技术日渐成熟，并已开始从动物试验向临床过渡。欧美已批准用于前列腺癌治疗。国内开展HIFU临床试验的研究早于国外，迄今已积累上万例临床病例。用于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、软组织肉瘤治疗。

尚待解决的问题：原位复发：体积较大的实体瘤组织特性和热传导性不均一。已有报道软组织肉瘤的HIFU治疗临床研究中有20%的原位复发率。肿瘤转移：已有几项研究报道HIFU治疗并不增加肿瘤转移的危险肿瘤转移仍然是病人死亡的主要原因研究热点：HIFU剂量学即超声剂量与治疗效应的关系、肿瘤影像学与治疗过程的实时跟踪监控及组织内的精确测温技术等方面。HIFU除可以杀灭原发灶肿瘤组织外，还可以增加机体的系统性抗肿瘤免疫

HIFU治疗小鼠体表Brown-Pierce肉瘤，当将其原位瘤破坏后其播散结节也自行消失。HIFU治疗荷神经母细胞瘤1300小鼠，治愈者再次接种同种肿瘤的肿瘤增殖率降低。肿瘤病人经HIFU治疗后，循环中CD3+CD4+T细胞数量及CD4+/CD8+T细胞数量比有所上升。HIFU治疗乳腺癌使同侧腋窝淋巴结内滤泡增多，生发中心扩大，淋巴细胞数量明显增多，78%的病例淋巴结为混合免疫反应增强型。

对HIFU调控免疫应答的作用机制及其潜能缺乏必要的深入研究。抗肿瘤免疫应答及DC的作用：HIFU增强抗肿瘤免疫的关键环节可能在于DC的活化和功能调节危险理论和危险信号：1994年Matzinger首先提出。认为诱发机体免疫应答的关键因素是机体细胞受损后产生危险信号。核心是接受APCs在免疫应答中的重要地位，认为APCs由损伤的细胞提供的危险信号所激活。危险信号：外源性内源性诱导性表达组成性表达肿瘤细胞可以产生并释放多种内源性DC激活因子热休克蛋白HSPsATP、GTP、mRNA、DNA及其代谢代谢产物UricＡcid等。核蛋白如HMBG1(HighMobilityGroupB1)正常情况下这些分子位于细胞内，但在损伤情况下可以释放至细胞外，激活DC。我们的工作假说：HIFU-treatmentreleaseofcytoplasmcomponentsactivationofDCs

Whatwewanttoknow:HowmuchcytoplasmcomponentscanbereleasedfromHIFU-treatedtumorcellsWhetherthereleasedcytoplasmcomponentscanactivateDCsWhethertheHIFU-triggeredDCactivationcanbreakdowntheimmunetolerancepromoteT-celltoactKillingoftumorcellHIFU实验系统：超声的热效应调整超声的声场参数可获得不同特点的温度变化曲线。

HIFU能对肿瘤组织内0.3～1mm范围升温至70℃以上而邻近2mm范围内则迅速降温至50℃以下。HIFU激活HSP的基因表达HSPs的抗肿瘤免疫活性已引起广泛的关注，因此，HIFU诱导肿瘤细胞产生HSPs的生物学效应如能适当加以利用，可以增强HIFU的免疫调控能力，具有重要的进一步研究的价值。Control55℃-10s65℃-10s75℃-10s85℃-10sHSPGeneactivationinvivo(Hsp70B-Luciferase)HSPGeneactivationinvitro(Hsp70B-GFP)PhaseContrastFluorescence2mmXYZ超声空化效应及其引起的肿瘤细胞机械性损伤和内源性危险信号的局部释放空化效应（Cavitation)：组织间的微气泡在超声波的负压相内迅速增大，又在正压相内被急剧压缩至崩溃，产生瞬间的高压和强大的冲击波，使气泡周围细胞的膜性结构破坏，导致细胞崩溃。超声空化效应在HIFU发展之初一般被尽量避免，但随后研究发现空化效应可以提高HIFU的治疗效果。热效应HIFUvs

机械性HIFUThermalHIFU:采用较低的超声压力以避免诱发空化效应，但采用较高的占空比以达到HIFU治疗中的快速升温（5s内温度上升至80℃），以模拟传统HIFU单纯的热效应MechanicalHIFU:采用较高的超声压力以诱发强空化效应，但采用极低的占空比（%DutyCycle）以避免温度的快速升高，降低HIFU的热效应TheoutputparametersofThermalandmechanicalHIFUtreatmentsininvitroexperimentsOutputParametersThermalHIFUMechanicalHIFUModulationBurstModeBurstModeFrequency(MHz)1.11.1PRF(Hz)2004P+(MPa)12.031.7P-(MPa)6.710.7DutyCycle(%)303Treatmentduration5s3×10s#PRF:pulserepetitionfrequency.#atanintervalof10s

ThephysicalparametersoftheHIFUexposureconditionsininvivoexperimentTreatmentStrategyP+(Mpa)P-(Mpa)DutycycleDuration(s)Ispta(w/cm2)Mechanical34.112.52%30723Thermal19.97.7100%312751细胞损伤和细胞内容物释放：体外实验：机械性HIFU导致肿瘤细胞的机械性破碎，内容物完全释放；热效应HIFU则导致凝固性死亡和内容物的不完全释放，对热敏感的危险因子如HSP60变性失活，仅对热稳定的危险因子如ATP得以不完全释放。从HIFU损伤的肿瘤细胞释放的内源性危险信号对DC的激活作用

Up-regulatedexpressionofCD80andCD86andenhancedsecretionofIL-12byDCsafterexposedtosupernatantsofMC-38tumorcellstreatedwithmechanicalorthermalHIFUExposureMeanFluorescenceIntensityIL-12secretionGroupCD80CD86(pg/ml)Medium127±6.1302±30.216.1±3.8Non-treatmentcontrol128±12.4308±26.540.3±5.0MechanicalHIFU154±2.8a402±8.5a111.2±8.9bThermalHIFU145±5.0a372±7.8a57.9±2.5a经机械性HIFU裂解的肿瘤细胞上情可刺激体外培养的DC高表达CD80、CD86，并分泌大量的IL-12。比较经热效应HIFU作用的肿瘤细胞上清，虽仍具有激活DC的作用，但生物活性明显低于前者。

体内实验结果：热效应HIFU可在3s内使组织温度上升至75度，但几乎检测不到空化效应；机械性HIFU处理时瘤内温度控制在55度以下，但引起强空化效应。不同的HIFU治疗所致的肿瘤组织损伤mechanical(left)andthermal(right)HIFUtreatmentHIFU治疗引起的DC瘤内聚集Day1Day2

Non-treatmentThermalHIFUMechanicalHIFUHIFU治疗引起的引流淋巴结肿大和DC迁移CFSECD11ca

HIFU诱导的CTL应答和对肿瘤再攻击的保护作用：经HIFU治疗的荷瘤小鼠体内检测到显著增强CTL应答并对肿瘤细胞的再次攻击产生保护作用。热效应HIFU诱导的免疫应答低于机械性HIFU。研究结论：HIFU肿瘤治疗中从损伤的肿瘤细胞局部释放的内源性的危险信号激活了DC的成熟,是HIFU增强抗肿瘤免疫的重要机制.提示HIFU治疗中过渡的热效应由于导致内源性危险信号的部分失活不利于抗肿瘤免疫的诱导，应强调HIFU适当的热效应并充分利用空化效应造成的肿瘤机械性损伤。HIFU有诱导抗肿瘤免疫的潜力，目前的HIFU治疗策略并未发挥出其免疫调控的最大潜力。进一步优化HIFU治疗的策略，强调HIFU适当的热效应并充分利用超声空化效应导致的机械性损伤，诱生内源性危险信号并促使其最大程度的局部释放，增强其激活DC，诱导抗肿瘤免疫应答的效能。下一步的工作打算：将HIFU技术