第5章环境毒理学常用实验方法

第五章环境毒理学常用实验方法第一节急性毒性试验急性毒性

急性毒性(acutetoxicity)是指机体(人或实验动物)一次或24h之内多次接触(染毒)外源化学物之后，在短期内所发生的毒性效应，包括引起死亡效应

所谓“一次或24内多次”接触或染毒的时间界定一次是指瞬间染毒，如经口染毒、经注射途径染毒，但在经呼吸道与经皮肤染毒，则是指在一个特定的期间内持续地接触化学物的过程，所以“一次”含有时间因素当外源化学物毒性过低，或一次染毒剂量受机体容量限制，需给予实验动物较大剂量时，则可在24h内分次染毒，即为“多次”。“短期内”，一般限定为7天内。

实验动物接触外源化学物所引发的急性毒性效应出现的快慢和毒性反应的强度，因外源化学物的性质（主要为化学结构与理化性质）和染毒剂量的大小而有很大差别。有的化学物在实验动物接触致死剂量后，几分钟之内即可产生中毒症状，甚至瞬间死亡，有的化学物则在接触致死剂量几天才出现明显的中毒症状或死亡急性毒性中毒症状与化学性质和染毒剂量的关系

急性毒性试验的目的

急性毒性研究的目的，主要是探求化学物的致死剂量，以初步评估其对人类的可能毒害的危险性。再者是求该化学物的剂量-反应关系，为其它毒性实验打下选择染毒剂量的基础化学物质的急性毒性分级毒性分级大鼠一次经口

LD50（mg/kg）6只大鼠吸入4h死亡2～4只的浓度（ppm）兔涂皮时

LD50（mg/kg）对人可能致死量（g/kg）总量（g）

（60kg体重）剧毒＜1＜10＜5＜0.050.1高毒1-10-5-0.05-3中等毒50-100-44-0.5-30低毒500-1000-350-5-250微毒5000-10000-2180-＞15＞10001ppm=1mg/kg=1mg/L=1×10-6常用来表示气体浓度，或者溶液浓度。实验动物的选择

毒理学中研究外源化学物的基础毒性主要是进行体内试验，即是以实验动物为研究对象，最终向外源化学物毒害主体—人类外推不同种属的动物对同一受试物的毒性作用表现可有很大的差别，要获得较可靠的实验结果，一般应选用两种以上的实验动物。常选用大白鼠和小白鼠。根据不同实验目的，可选用不同实验动物描述性动物实验研究采用的体外试验研究的模型标本包括某些离体脏器、组织切片、原代细胞、传代培养细胞、组织匀浆、亚细胞组分，甚至昆虫、细菌等

染毒途径和方式

经口染毒经呼吸道染毒经皮肤染毒其它途径染毒

经口染毒

灌胃喂饲吞咽胶囊灌胃

人工给实验动物灌入外源化学物是经常使用的经口染毒方法。此时外源化学物直接灌入胃内，而不与口腔及食道接触，故而给予的化学物剂量准确。但是，当待测化学物为气态或固体时均需用某种溶剂溶解，液态化学物往往也需用溶剂溶解灌胃体积依所用实验动物而定，小鼠一次灌胃体积在0.1～0.5ml/kg体重，大鼠在1.0ml/100g体重之内，家兔在5ml/kg体重之内，狗不超过50ml/10kg体重

喂饲

喂饲方法染毒是将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物自行摄入含化学物的饲料或水，然后依每日食入的饲料与水在推算动物实际摄入化学物的剂量喂饲法的优点是接触化学物的方式符合人类接触污染食物与水的方式,方法简便、易操作。但往往摄入的化学物量不准确，仅适用于动物数量较大的毒理学实验由于此种方法更适宜进行多日染毒，急性毒性试验一般不用之吞咽胶囊

将所需剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放到动物的舌后咽部迫使其咽下。此法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异臭的化学物。兔、猫及狗等较大动物可用此法经呼吸道染毒

凡是气态或易挥发的液态化学物均有经呼吸道吸入的可能，在生产过程中形成气溶胶的化学物也可经呼吸道吸入经呼吸道染毒有两种类型

动物自行吸收静式吸入染毒动式吸入染毒人工动物气管注入将液态或固态外源化学物注入肺内。这是一个手术过程，仅适用于制造化学物对肺脏损伤模型的制备，而不用于一般毒性研究

经皮肤染毒

研究外源化学物的经皮吸收时，皮肤接触化学物的面积、时间长短、环境中温、湿度均应控制统一的条件为保证不因皮肤部位不同而形成的化学物渗透率差异，一般大鼠、豚鼠、兔均使用背部皮肤其它途径染毒

有时需对外源化学物进行绝对毒性或比较毒性研究，或进行一些必要的特殊研究(如静脉注射毒物动力学、代谢研究、急救药物筛选等)，往往用注射途径染毒注射途径包括静脉注射(大鼠、小鼠尾静脉，兔耳缘静脉)、肌肉注射、皮下注射及小动物腹腔注射染毒。但注射时应控制注射体积毒性反应的观察与检查

根据急性毒性试验的目的，受试动物给予受试物后，应即刻密切观察各组动物发生的毒性反应（全身的或局部的）情况，中毒症状的特点和出现时间，中毒症状恢复时间，动物发生中毒死亡的时间及死亡数，死亡动物必须的病理解剖检查观察等试验的观察期限，如受试动物于接触受试物后24～48h内中毒死亡，未发现有迟发中毒作用时，一般观察7～14d即可

急性毒性常用指标

急性致死毒性最常用的指标是LD50，它是经过统计处理计算得出的数值，与LD100、LD0等相比有更高的重现性

LD50表示一种外源化学物引起实验动物死亡一半的剂量(或浓度）非致死性急性毒性

为了克服致死性急性毒性只能提供死亡指标这一缺点，非致死性急性毒性的概念显得比较重要，它可提供常规的非致死急性中毒的安全界限和对急性中毒的危险性估计

LD50的测定

测定LD50常选用成年小鼠和大鼠两个种属，有时需选用其它种属。无特殊要求，雌雄两性各半正式试验时一般每组10只动物，在预测的LD100及LD0之间安排5～7个剂量组

LD50值的计算有多种方法，大体上可以归纳为两大类，其一是死亡率—剂量反应相关要求为正态分配的，其中概率单位图解法和寇氏法(Karber)较为常用。另一类是不要求为正态分布的（非正态分布），计算时只查对有关表格即可得到LD50寇氏法

此法计算LD50较为简便，但实验要符合下列条件：各个实验组动物数相同各组剂量要按等比级数分组最大剂量的死亡率最好为100%或与之接近，最小剂量的死亡率为0%或与之接近计算公式

LogLD50=Xm-i(∑P-0.5)

式中Xm—最大剂量的对数值

i—相邻剂量比值的对数∑P—各组死亡率的总和（以小数表示）急性毒性分级

为了粗略表示外源化学物急性毒性的强弱和其对人的潜在危害程度，国际上提出了外源化学物的急性毒性分级（acutetoxicityclassification）。但分级标准并未完全统一我国目前除参考使用国际上几种分级标准之外，又于1978年提出了相应的暂行标无论我国或国际上急性分级标准都还存在着不少缺点，有待逐步改进农药的急性毒性分级

工业毒物急性毒性分级标准

WHO推荐的外源化学物急性毒性五级分级标准

LD50影响因素

试验动物的内外环境各种因素的影响试验人员操作熟练程度受试化学物的浓度或稀释倍数的影响同一外源化学物在同一品系动物和同样接触途径所测定的LD50值也会有一定差异，甚至可有2～3倍的波动范围急性毒作用带(acuteeffectzone，Zac)

LD50

Zac=Limac

式中：LD50代表毒性上限，Limac

急性阈剂量代表毒性下限。

Zac值的大小可反映急性阈剂量距离LD50的宽窄。Zac值越大表明化合物引起急性死亡的危险性越小，反之表明引起急性死亡的危险性越大

非致死性急性毒性

急性毒性只能提供死亡指标，非致死性急性毒性可提供常规的非致死急性中毒的安全界限和对急性中毒的危险性估计非致死性急性毒性试验要求测定急性毒作用阈（Limac）。毒性效应是一种或多种毒性症状或生理生化指标改变。对于某些生理生化的改变，如体重、体力或酶活性等，Limac是指均值与对照组比较时，其差异有统计学意义的最低剂量非致死性急性毒性实验观察效应很多，首先明确观察效应

第二节蓄积性毒性试验

毒物蓄积性的定义

外源化学物进人机体后，经过代谢转化以后代谢产物或者以未经代谢转化的原形母体化学物排出体外。但是当化学物反复多次染毒动物，而且化学物进入机体的速度或总量超过代谢转化的速度与排出机体的速度或总量时，化学物或其代谢产物就可能在机体内逐渐增加并贮留某些部位。这种现象就称为化学物的蓄积作用(cumulation)，大多数蓄积作用会产生蓄积毒性

蓄积毒性（cumulativetoxicity）

蓄积毒性是指低于一次中毒剂量的外源化学物，反复与机体接触一定时间后致使机体出现的中毒作用一种外源化学物在体内蓄积作用的过程，表现为物质蓄积和功能蓄积。物质蓄积和功能蓄积往往是同时存在又互为基础，在实际工作中常难于严格区别外源化学物在机体内所产生的蓄积作用是引起亚慢性毒性作用和慢性毒性作用的基础受试物的蓄积毒性强弱是评估它的毒性作用指标之一，也是制定卫生标准时选用安全系数大小的重要参考依据物质蓄积

物质蓄积指外源化学物反复进入机体内，在体内的吸收量大于排出量，并在体内逐渐积累的过程物质蓄积可以用化学方法测得机体内(或某些组织脏器内)存在该化学物母体或其代谢产物，例如重金属铅、汞、锰等，又如DDT代谢物功能蓄积

功能蓄积指不断进入机体的外源化学物，对机体反复作用并引起功能发生改变累积加重，最后导致出现损害作用的过程。功能蓄积往往测不出该物质，如某些有机溶剂、有机磷化合物等评价毒物蓄积性的方法

※蓄积系数法

☆固定剂量法

☆递增剂量法

※生物半减期法※蓄积率测定法蓄积系数法

蓄积系数是指多次染毒使半数动物出现毒性效应的总有效剂量(ED50（n）或LD50（n)与一次染毒的半数有效量（ED50（1）或LD50（1））之比值，毒性效应包括死亡蓄积系数法的原理是在一定期限内,以低于致死剂量(＜LD50)的剂量，每日给实验动物染毒，直至出现预计的毒性效应(如半数动物死亡)为止，然后计算蓄积系数(cumulativecoe-fficient,Kcum)半数有效量（mediaeffectivedose,ED50）指某一物质使50%的试验动物产生效应的剂量

蓄积毒性分级

Kcum蓄积毒性强度

﹤

1高度蓄积

1～明显蓄积

3～中等蓄积

5～轻度蓄积固定剂量法

取大鼠或小鼠，以灌胃或腹腔注射给予受试化学物。先求其LD50，再以相同条件将40只或以上动物，雌雄各半，均分两组，一为染毒组，一为对照组对受试动物按1/10～1/20ED50（1）（LD50（1））的固定剂量，连续每天进行染毒一次，观察记录受试动物出现的某种毒性效应或反应情况固定剂量法评价蓄积作用的方法

当染毒剂量累计达到相当5倍ED50（1）或LD50（1）以上时，若受试动物中出现某种毒性效应或死亡动物数未超过半数，此时的蓄积系数已大于5，表明该受试物的蓄积毒性作用不明显如果染毒过程中受试物中相继出现某种毒性效应或死亡的动物数累计达到50%，此时算出受试物累计的染毒总剂量，按上述公式即可计算出受试物的蓄积毒性系数递增剂量法

以4d为一期，开始第一期每天染毒剂量为1/10ED50或LD50，随后染毒剂量每隔4d按1.5倍递增一次定期递增染毒剂量*表

染毒日期（天）每日染毒剂量

每4天染毒总剂量

累计染毒总剂量

1～40.100.40.45～80.150.61.09～120.220.91.913～160.341.43.317～200.502.05.3

注：表中的递增染毒剂量*为×ED50或LD50

递增剂量法评价蓄积作用的方法

如果连续染毒已达20d，此时染毒的总剂量已累计达到5.30倍的ED50或LD50，受试动物中出现某种毒性效应或死亡的动物数未达到50%，则表示该受试物的蓄积毒性不明显，试验可以终止如受试物在试验过程中，相继出现的某种毒性效应或死亡的动物数累积达到50%，即可计算出蓄积系数并可对蓄积毒性强度作出评估生物半减期法

生物半减期（biologicalhalftime，简称T1/2）指进入机体的外来化学物质通过机体的生物转运和转化作用过程而被消除一半所需要的时间生物半减期法是用毒物动力学原理来描述外源化学物的体内蓄积作用外源化学物在机体内蓄积的速度和量与单位时间内机体对受试化学物的吸收速度、清除速度有关生物半减期的测定

在实际观测中，常常仅以间接测定它们在血液、尿液或器官组织中的浓度（或量）降低一半所需的时间，来代表该物质的生物半减期通常的方法是机体接触受试物后，在一定时间的间隔内，分别测定血液或尿液、器官组织中该物质的浓度（或量），依据所得结果按下式求出它的生物半减期生物半减期（T1/2）

=（t2

–t1）log2/（logy1–

logy2）

式中：y1和y2—分别为给受试物后在t1和t2时间取样测定的该物质的含量。根据测定生物半减期的长短，判定受试物的蓄积毒性大小蓄积率测定法

蓄积率(cumulativepercent)测定法，常用的动物为小鼠或大鼠首先将受试动物分成蓄积和对照两大组，每组60～70只。蓄积组动物每次按一定剂量(低于最小致死量)按同一给毒途径预先给受试物，经过一定时间之后，按常规方法测定蓄积组和对照组的LD50，并按下式计算蓄积率:

蓄积率=（对照组LD50-蓄积组LD50）/蓄积组预给受试物的总剂量×100%蓄积率应标明预先给受试物的时间及剂量，在相同时间及剂量条件下，蓄积率越大则表示该物质在体内的蓄积作用越强，反之则越弱。第三节亚慢性和慢性毒性试验

亚慢性与慢性毒性试验的重要性

通常情况下，人类对生活和生产环境中的有害化学和生物因素接触水平较低，不至于发生急性中毒，却在长期反复接触中发生慢性中毒另外，虽有些化学物测不出急性毒性或急性毒性极低，但却有慢性毒性

亚慢性毒性试验

亚慢性毒性(也称亚急性毒性)指机体在相当于1/20左右生命期间，少量反复接触某种有害化学和生物因素所引起的损害作用研究受试动物在其1/20左右生命时间的，少量反复接触受试物后所致损害作用的实验，称亚慢性毒性试验(subchronictoxicitytest)或亚急性毒性试验(subacutetoxicitytest）

以大鼠为例，平均寿命为两年，即24个月，因此，亚慢性毒作用试验的接触期为1～2个月左右

亚慢性毒性试验目的

急性毒性试验的基础上，进一步观察受试物对机体的主要毒性作用及毒作用的靶器官，并对最大无作用剂量及中毒阈剂量作出初步确定亚慢性毒性试验的结果，可为慢性试验设计选定最适观测指标及剂量提供直接的参考

慢性毒性试验(chronictoxicitytest）

慢性毒性是指外源化学物质长时间（大于1/10生命期）少量反复作用于机体后所引起的损害作用。研究受试动物长时间少量反复接触受试物后，所致损害作用的试验称慢性毒性试验(chronictoxicitytest），亦称长期毒性试验(longtermtoxicitytest)要求试验动物生命的大部分时间或终生长期接触受试物。各种试验动物寿命长短不同，慢性毒性试验的期限也不相同贵州省织金县青壮汉拄拐杖--氟慢性中毒30岁的人60岁的肺-一名工人展示自己体检的胸片因矽肺病死亡丈夫的遗孀合影

慢性毒性试验的主要目的

确定化学物毒性下限，即确定机体长期接触该化学物造成机体受损害的最小作用剂量(阈剂量)和对机体无害的最大无作用剂量为制定外源化学物的人类接触安全限量标准提供毒理学依据

如最大容许浓度，每日容许摄入量（acceptabledailyintake，简称ADI，以mg/kg体重d表示）等

最大耐受剂量(MTD)

在亚慢性或慢性试验条件下，在此剂量下实验动物无死亡，且无任何可察觉的中毒症状但是实验动物可以出现体重下降，不过其体重下降的幅度不超过同期对照组体重的10%的最大剂量慢性毒作用带(chroniceffectzone，Zch)

以急性毒性阈值(Limac)与慢性毒性阈值(Limch)比值表示外源化学物慢性中毒的可能性大小比值越大表明越易于发生慢性毒害实验设计的原则

试验动物试验分组及剂量选择接触途径指标观察与测量

试验动物

亚慢性试验、慢性试验首先要考虑对受试物敏感的动物种属和品系应考虑到被选用的动物供应方便，价格适中，易于饲养管理。最常用的动物有大鼠、小白鼠、狗和家兔，其次猫、琢鼠、猴等亦可供使用。一般要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种试验动物的性别一般要求雌雄各半长期毒性试验，应选用年幼、初断奶的动物作为试验对象亚慢性毒性试验分组及剂量选择

亚慢性毒性试验设一个对照组和3～4个剂量组以急性毒性的阈剂量为亚慢性毒性试验的最高剂量，或者以受试物的急性LD50值的1/10～1/5为最高剂量。最低剂量组动物应不出现毒性反应接近亚慢性阈剂量水平，中间设1～2个剂量组

慢性毒性试验分组及剂量选择亚慢性毒性试验设一个对照组和4～5个剂量剂量选择可依据两个途径:以亚慢性毒性效应的1/5～1阈剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以亚慢性毒性效应的1/50～1/10阈剂量为预计慢性阈剂量，以其1/100为最低剂量，在最高剂量与预计慢性阈剂量之间再加1～2个剂量组是以急性毒性效应为出发点，以LD50(或LC50)为基础，以l/10LD50为最高剂量，以1/100LD50为预计慢性阈剂量，以1/1000LD50为最低剂量。在1/10LD50与1/100LD50之间再加1～2个剂量组

接触途径

自然摄入但是如受试物有异味或易水解时，也可以用灌胃方式。为了保证给受试物的精确度，目前一般采用灌胃法，每日灌胃应当定时进行。经呼吸道吸入，每日吸入期时间的长短依试验要求而定。对工业毒物进行慢性毒性试验时，通常要求每日吸入4～6h。环境污染物一般要求每日吸入8h，甚至24h经皮肤接触一定要注意在每日固定的时间内给相同的量。另外，根据人类接触受试物的实际途径，还可采用皮下、肌肉、静脉、腹腔注射等，这些方法均可保证给予受试物较精确的量。受试物最好是每周7d连续给予，如试验期超过3个月时也可采用每周给6d。每天给受试物时间相同指标观察与测量

一般状况指标的观察生物化学指标的观测病理学检查分子生物学和免疫学指标的测定检测指标的时间恢复期观察各国测试标准比较一般状况指标的观察

中毒症状的观察体重测量水和食物摄入量的观测

生物化学指标的观测

肝脏功能肾脏功能血液学指标的检测生物材料中受试物及其代谢产物的检测病理学检查

系统尸解脏器系数组织学检查

脏器系数

是指某个脏器与单位体重之比值或称脏/体比值。单位体重通常以100g体重计,如肝/体比，即指(全肝湿重/体重)×100依据是实验动物在到达成年末期或老年期之前,尤其是小动物均随着年龄的增加体重增长,且各脏器与体重之间的重量比值有一定规律若某脏器受到受试化学物损害,此比值将发生改变，在排除称重前的失水、年龄、性别、营养不良等因素的影响后,脏器系统增大,表示脏器充血、水肿或增生肥大性变化等；脏器系数减小,表示脏器萎缩、退行性变化等一般包括心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫、脑、前列腺等

第四节评价联合毒性的方法

评价联合毒性的方法

联合毒性(jointaction或combinedeffect)指两种或两种以上毒物同时或前后相继作用于机体而产生的毒性作用（已在第四章阐述）常用的方法：

联合作用系数法等效应线图法

联合作用系数法

混合化学物预期LD50计算公式

式中：A、B、------N，代表混合物中的各化合物；

a、b、------n，分别为各化合物在混合物中所占的比例，所以a+b+----+n=1.联合作用系数法K值

通过动物试验测定混合物的LD50，再求出混合物的预期LD50与实测混合物LD50的比值，此比值即为K值如果各化学物是相加作用，则理论K值应等于1，但由于测定LD50本身会有一定波动，所以K值也会有一定波动(K＝l±)。一般认为K值在0.4～2.5之间表示相加作用；＜0.4表示拮抗作用；＞2.5表示协同作用等效应线图法

这种方法只能评定两个化学物的联合作用，具体步骤如下：

1、在同种试验动物和相同接触途径条件下,分别算出两种化学物(A和B)的LD50及其95%可信限，以纵座标表示化学物A的剂量范围，以横座标表示化学物B的剂量范围，分别将两种化学物在纵座标与横座标上的LD50值及95%可信限的上下限值连成三条直线。

2、以等效应剂量求出两个化学物混合后的LD50值。

3、根据混合LD50，求出两个化学物各含的实际剂量，分别在相应的座标线上找到各自的剂量位置，并由相应剂量点作垂直线，视其交点所落的位置进行评定。

4、如交点正好落在两个化学物95%可信限的上下两条线之间，表示为相加作用。如交点落到95%可信限下限以下，则表示为协同作用。如交点在95%可信限上限直线以外，则表示拮抗作用。

第五节致突变试验

、、、基本概念

变异（variation）生物的个体和各代之间存在着种种差异突变（mutation）基于染色体和基因的变异才能够遗传，而遗传变异称为突变突变可分为：

自发突变(natural或sporadicmutation)和诱发突变(inducedmutation）诱发突变指由于物理、化学、生物等环境因素引起的突变诱发基因突变的原因物理因素有

X射线、γ射线、α射线、β射线、快中子和紫外线等

化学因素可大致分为烷化剂、碱基类似物、抗生素等，以及一些零星的化学诱变剂生物因素如黄曲霉毒素等突变的类型染色体畸变(chromosomeaberration)：

1、染色体数目的畸变

2、染色体结构的畸变基因突变（genemutation）：

1、自然突变，又称自发突变

（spontaneousmutation）

2、诱发突变（inducedmutation）

多Y综合征

先天性卵巢发育不全症（XO）

先天性卵巢发育不全症（XO）21三体综合征

基因突变的类型碱基置换（basesubstitution）

转换（transition）

颠换（transvesion）移码(frameshift)突变

显性致死（非遗传性改变）

接触某种有效剂

性细胞突变

量的致突变物

能传递的遗传改变

哺乳动物

诱发突变

肿瘤

体细胞突变

畸胎（胚胎期接触）

突变的后果

生殖

1、性致死突变（非遗传的变异）∶

接

细

不能与异性细胞结合，胚胎早期死亡，故对基因库无影响

触

胞

2、遗传性变异（非致死性突变）∶

有

突

（1）、染色体病

效

变

（2）、显性突变遗传（如多指、多趾

剂

（3）、隐性突变遗传（如白化病）量

的

体

诱

细

1、胚胎或胎儿细胞受影响∶

变

胞

胚胎畸形、胚胎死亡剂

突

2、癌肿……

变受伤前的宋学文受伤后的宋学文美国明星约翰.韦恩

13年后的孙渤已是老气横秋

遗传毒理学在环境监测中的重要性和必要性传统的理化分析不能满足环境监测的要求首先，遗传毒物因其理化性质以及数量很微或在环境中降解为某些未知产物，理化分析非常复杂或困难，因而环境样品的生物实验常常显示有致突变性而不能用理化方法测量出来第二，遗传毒物仅占环境物质中的一小部分，要单独分离检测这些遗传毒物，显然难度较大第三，环境中遗传毒物对生物体的作用往往不是单个物质的作用，而是多个物质的联合作用，仅用理化分析不能提供化学混合物中各组分对生物活性综合效应的资料致突变性评价方法

检测外来化学物的致突变性一般通过致突变实验来进行。其目的主要有两点：检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人体的遗传危害性实验方法的研究很快，原有方法日益完善，新方法也不断建立，对每个实验所反映的事件的认识不断深化。目前，已有致突变实验两百余种，但常用的较重要的仅十余种。致突变试验在环境检测（监测）中的应用

环境中采集样品的遗传毒性监测现场环境的遗传毒性直接监测环境化学物的“三致”效应检测环境放射性监测

对特定环境中人类健康的监测环境样品的采集和前处理

根据研究目的设置污染区和对照区采样点（包括部位与数量）、采集研究的环境样品。重要的是采集的环境样品能代表所关注的混合物，其次是随机化采样技术和标准化的采样方法。合理的样品前处理方法是有效遗传毒性检测的必要前提。1992年制定的《有机污染物遗传性检测的环境样品前处理规范》，是国家环保局提出的标准，目的是制定污染物有机组分遗传毒性检测时环境样品前处理的技术要求，保证将检测结果的偏差减到最小，使实验室间的检查结果具可比性，从而给具诱变性、致癌性、致畸性有机污染物的管理与控制提供科学的依据。样品的处理通常采用两种策略：即提取总的混合物和分离成不同组分（单个化合物或几类化合物）。《有机污染物遗传毒性检测的环境样品前处理规范》大气可吸入颗粒物地面水及废水非水液态废弃物土壤及沉积固体废弃物环境中采集样品的遗传毒性监测

环境采集样品的监测就是先将环境介质(空气、水、土壤)或动植物体内的遗传毒物提取出来，然后在实验室内对微生物、高等植物、水生生物、哺乳动物及人体细胞在体外或整体条件下，在实验室内进行遗传毒理学检测，通过生物遗传学效应的测试，从而为环境中遗传毒性的危险度评价提供资料。空气

空气采样通常采用大流量采样器采集，另外也可采用个体采样器采集。如研究大气沉降灰尘则采用灰尘采样罐。含悬浮颗粒物通常被收集在滤膜上，也可吸附在树脂上；还可通过降温方法收集冷凝物。采集在膜上的样品根据污染物性质和研究目的可用不同的有机溶剂提取，常用的有机溶剂有环己烷、苯-己烷-异丙醇混合物、二氯甲烷-丙酮、甲醇、环己烷-甲醇、丙酮、甲苯-丙酮、苯甲醇、硝基甲烷等。提取的样品经过滤（也可不过滤），然后浓缩至干，再定量溶于二甲基亚砜中供实验用。水少数情况可采用原水，大多数水体因有机物的总浓度低于1×10-6

mg/L，通常需要先对水样中的有机物进行浓集。浓集水中有机物的方法有多种，如液-液萃取法、冻干脱水法、吹气提取法、吸附法等，其中以XAD树脂吸附法应用最广。对于无悬浮固体的水样直接通过树脂柱浓集即可，对于含固体悬浮物的水样，可先过滤再过柱，过柱后选择适当的溶剂将悬浮物洗脱下来，常用的解析有机溶剂有：乙醚、丙酮、甲醇、二醇、苯、乙酸乙酯、乙氰、石油醚等。为提高有机溶剂对XAD树脂吸附物的洗脱力，可将两种（或两种以上）的溶剂混合或先后使用。土壤

通常采集1kg左右的土样，经阴干碾碎过筛，要求颗粒大小在1～10μm，再用苯-甲醇4∶1提取液（甲醇，氯仿等）于索氏提取器中提取，将提取液置于浓缩器中浓缩后真空干燥，二甲基亚砜定容，供实验用。动植物

鱼贝类剥去贝壳或鳞，将肉粉碎，也可取某些脏器或部位的组织加以粉碎，称取一定量放于索氏提取器中，用乙醚等提取液提取，将提取液转移至旋转蒸发器中干燥，定容于二甲基亚砜中供实验用。蔬菜样品，首先弃不可食部分，蒸馏水洗净，烘干（60～65℃），碾磨，过筛，然后取一定量用索氏提取器提取有机物，提取液可采用苯-甲醇（4∶1）等适宜的溶剂，然后干燥定量供测试用。环境采集样品遗传毒性监测方法微生物试验植物水生生物昆虫两栖类

微生物试验Ames试验SOS／umn试验发光细菌暗变种试验单细胞生物DNA损伤和修复的研究真核微生物单细胞凝胶电泳试验植物1978年Grant等报道了紫露草、蚕豆、玉米、大麦、大豆、豌豆、番茄、洋葱、百合、烟草和还阳参12种植物的细胞染色体畸变检测方法可作环境监测1981年，美国环保局(EPA)把紫露草微核分析列入环境监测项目之一。我国、日本、加拿大、墨西哥、印度、前苏联等也先后采用目前已用于DNA加合物测试的植物有豌豆、菜豆、大麦叶、紫色锥形花、烟草、番茄、紫露草、郁金香等水生生物脊椎动物细胞遗传学试验

除鱼类外周血红细胞微核外，还有显性致死试验、SCE分析、程序外DNA合成试验及DNA加合物分析等非脊椎动物如海胆、双壳类软体动物的分裂后期染色体畸变分析、贝和海胆的微核试验、海胆的显性致死试验、淡水涡虫单细胞凝胶电泳技术、贝DNA加合物分析等。昆虫

如果蝇伴性隐性致死试验、蚯蚓体腔细胞彗星试验等采用彗星试验技术检验蚯蚓活体暴露过程中DNA损伤水平，并结合统计学分析方法对“彗星”尾矩、尾长等参数表示的实验数据进行分析，能够更为准确地定量描述化学品和土壤中污染物造成的动物细胞DNA单链断裂。该技术作为一种敏感、方便、快速的生物标记方法，对于实验室内和野外实地考察土壤整体环境质量，判断污染物质的遗传毒性效应具有重要应用意义。现场环境的遗传毒性直接监测

现场生物的直接测试，是用现场被污染的生物直接进行遗传毒理学检测来评价环境遗传危险度现场遗传毒性监测通常采用的生物是当地产的有花植物、水生脊髓动物和无脊髓动物、小的陆生哺乳动物，也可使用替代个体或种系。替代生物可从温室、实验室或农场转移到拟观察现场，也可从观察现场转移到实验室或从某一现场转移到另一现场。现场直接监测的重要性

在环境中没有一种生物系统是仅受单个化学作用的，由于环境化学物诱发的有害生物效应大部分是某特定环境中各种化学和物理因素之间复杂作用的结果，即这些毒性效应常常是复杂混合物中不同化学物相加、相乘或拮抗作用，以及与物理因素相互作用的结果。这种不同因素相互作用和动态变化的环境，要在实验室里复制出来，几乎是不可能的。进入环境的很多气态致突变物是短寿的，并且可能与其他化学物迅速发生相互作用，难于用采集环境样品的方法来进行生物监试。因此，从危害性鉴定和环境评估来讲，直接监测现场环境中生物体的遗传毒性效应是非常有价值的。环境化学物的“三致”效应检测

据估计，目前环境中大约已有10万种人工合成的化学制剂，而且正以每年近1500种的速度递增．其中10％的化合物的制造量足以威胁到环境的安全，因此，在将其排放到环境中之前，需要进行必要的风险评估(riskassessment)．一般的化学监测l方法虽然能对环境或生物体内污染物含量进行定量描述，但仅凭含量无法反映这些污染物对生物的效应，而一般的毒性试验也无法反映具对生物体的潜在危害，即对下一代的影响，如“三致”效应等。这须应用环境遗传毒理学方法对其进行检测。环境放射性监测

随着核技术的发展，放射性废水的直接排放，造成了局部水域的放射性核素污染；例如：1945—1980年全世界共进行的543次大气层核试验和二战后期日本广岛、长崎原子弹爆炸产生了大量放射性裂变产物造成了全球范围内的人工放射性核素的污染；1986年4月前苏联切尔诺贝利核电站事故又导致大量放射性物质的泄漏，污染了整个北半球；另外，燃煤发电、磷酸盐矿开采、稀土工业等发展，使天然放射性核素发生了转移和再分布。这些放射性核素经自然沉降、雨水冲刷等造成了局部地区及全球江河水系的放射性污染，对水体构成了一定的放射性污染，从而危害人体健康。为此，世界许多国家和地区对水体中放射性污染进行了多方面的研究。对特定环境中人类健康的监测人们日常生活居住的环境是人类大环境中赖以生存和繁衍的特定环境，这种特定环境的质量与否，对人类的重要性是不言而喻的。加强对特定环境的监测，特别是遗传毒学的检测/监测，是关系人们健康的重中之重的大事，应为环境保护工作者所重视。人群监测（humanpopulationmonitoring）是评价人类在生活和职业环境中接触遗传毒物的水平，以及对人体的生物效应。常用的遗传毒理学方法介绍

细菌回复突变试验

（Ames试验)

哺乳动物细胞株突变试验

正常细胞突变细胞株（V-79细胞株

CHO细胞株）DNA合成时能利用具有不能利用碱基类似物，不中毒毒性的嘌呤碱类似物使中毒不能在培养基上生长

微核试验染色体畸变试验显性致死突变试验（dominantlethalmutationtest）

本试验是检测外来化合物对动物生殖细胞染色体的致突变作用。与骨髓细胞染色体畸变分析不同之处在于前者观察体细胞染色体本身的结构和数目的变化，而本试验系观察胎鼠的成活情况。因为哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时（染色体断裂或重组），往往不能与异性生殖细胞结合，或使受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。

姐妹染色单体交换试验（SCE试验）单细胞凝胶电泳(SCGE)单细胞凝胶电泳(SCGE)SCGE是一种在单细胞水平上检测DNA链损伤的方法原理：包埋在琼脂糖凝胶中的细胞在中性或碱性条件下经裂解与解旋后，带负电荷的DNA游离断片，在电场作用下向阳极迁移。细胞经溴乙锭（ethidiumbromide）染色后在荧光显微镜下观察，受损DNA形成形似彗星的影象，故又称“彗星试验”（CometAssay）实验流程加受试物染毒制片

细胞裂解解旋、电泳

中和EB染色

镜检计数统计分析制单细胞悬液典型彗星图象

果蝇遗传毒理学试验果蝇伴性隐性致死试验

果蝇的性染色体和人类一样，雌蝇有一对x染色体，雄蝇则为xy。伴性隐性致死突变试验的遗传学原理，在于致突变物可变在雄性果蝇配子x染色体上诱导隐性致死突变。将经处理的雄蝇与未经处理的雌蝇（x染色体上常有易鉴别的表型标记，以区别父本或母本的x染色体）交配，此时产生的子1代（F1）雄蝇带有来自父本的具致死突变的x染色体。但由于此种致死突变为隐性，所以F1雌蝇仍然能正常生长、发育、生殖。若将此类雌蝇F1与子1代雄蝇交配，则将有半数雄合子是含有经受试物处理的雄蝇（P1）的x染色体。此时x染色体上隐性致死基因得以表现，引起此雄蝇死亡DNA加合物研究及其毒理学中的应用

DNA加合物形成

DNA加合物是亲电性加合物及其代谢产物和生物体内的DNA形成的共价结合产物DNA加合物的形成被认为是致癌过程的一个重要阶段

32P后标记法基本原理

1、

含有加合物的DNA链在内切酶的作用下降价为3，单磷酸苷；2、

通过消除正常的核苷酸来富集加合物的核苷酸；3、

在特异的T4

多核苷酸激酶的作用下，将具有高度特异活性的32P-ATP的磷酸根基团转移到加合的核苷酸的5，-羟基末端，使其形成3，-5，二磷酸核苷；4、

将标记的加合物通过薄层层析分离；

5、放射自显影及定量分析。

参与形成DNA加合物的活性化合物

外源性的（天然的和人工合成的）化合物，例如多种环境污染物某些药物（抗癌药物）内源性化合物（如雌二醇）DNA加合物的实际应用DNA加合物作为生物标志物用于肿瘤流行病学研究DNA加合物的水毒理学研究

DNA加合物在环境监测中的应用用DNA加合物作为指标检测和筛选致癌物用DNA加合物作为指标检测和筛选致癌物建立用鱼进行致癌物检测与筛选的模式系统对日常生活中常用的化学品的潜在致癌性进行研究对天然水体中鱼样的DNA加合物测定及相应水体的水和沉积物诱导形成DNA加合物的能力的实验室研究

第六节致畸试验

基本概念

器官形态结构的异常称为畸形（malformation）胎儿出生时即具有整个身体或某一部分的外形或器官的解剖学上的形态结构异常称为先天畸形（congenitalmalformation）畸形的胚胎，称为畸胎（terate）凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物称为致畸物（teratogen）或致畸原评定外源化学物是否具有致畸作用的试验，称为致畸试验发育毒性

某些化合物可具有干扰胚胎的发育过程，影响正常的发育作用，即发育毒性。发育毒性的具体表现可分为：

1、生长迟缓(growthretardation)2、致畸作用(teratogenicity)3、功能不全和异常

4、胚胎致死作用(embryolethality)环境因素与人体健康原生环境指天然形成的环境条件，主要是地质条件。如高山区地质性原因形成的缺碘区、高氟地区以及高放射本底地区等有害于健康的环境次生环境是随人口密集、工业发展、能源利用、生活和生产中产生的废弃物大量排放、人为造成的污染环境原生环境与出生缺陷

※

碘地区与碘缺乏病（IDD）

※高氟地区与先天性氟中毒

※水质硬度有关的出生缺陷

※高放射活性地区与畸形发生率

※气象与胎儿畸形克汀病印度一名患有氟骨症的男子在他嫂子的帮助下进食印度患有氟骨症的8岁男孩巴拉克试图站立起来彩图9美国明尼苏达州畸形豹蛙彩图15五条腿的黄牛60年代初，欧洲发生的反应停（塞利米多，thalidomide）事件揭开了化学致畸性研究的序幕

美国的一个“反应停”受害女孩，已经学会用她仅有的一只手绘画马丁·施奈德斯是荷兰第一个“反应停儿童”。在年纪很小的时候，他就已学着以残疾之身生活下去，并逐渐掌握了一系列技能，包括弹奏电风琴。

被反应停夺去胳膊的孩子们

致畸原的特点不同类型的致畸原，导致不同类型先天缺陷致畸原的理化性质作用剂量作用时间不同类型的致畸原，导致不同类型先天缺陷

X-射线可引起脑小畸形、小眼球症；反应停引起短肢畸形；甲基汞引起婴儿脑性麻痹及精神迟钝等。致畸物的吸收及在体内的代谢、分解

分子量小，极性小，未电离，高脂溶性未与母体血浆蛋白质结合均易透过胎盘屏障。但母体接受的化学物剂量大，在血中产生足够的浓度时，即使是脂溶性低和呈离子态的，也能到达胎儿血；某些化学物能迅速穿过胎盘，进入胎儿血，达到比母体血中还高的浓度，如氨苄青霉素，胎儿血中的浓度，比母体可高出7倍致畸物的化学结构

化学物质好的致畸作用还与其化学结构有关。在孕期中蛋白质代谢紊乱可能会引起畸胎，例如，某些农药好的化学结构中有嘌呤基，可能直接或间接地对体内的嘌呤基代谢起作用，从而破坏了胚胎的正常发育过程，而形成畸胎。在某些有致畸性的化学物质中有维生素拮抗剂、氨基酸拮抗剂、核酸拮抗剂和烷化剂等，这些物质都可以起着抗代谢的作用，也可能引起畸胎

作用剂量

在同一发育阶段，致畸率及程度随致畸原好的剂量（或强度）增加而升高，且呈剂量—反应关系。各种致畸原均有其引起畸形发生的阈作用剂量，高于此剂量时开始出现畸胎。剂量越大，畸胎率越高，致畸敏感期越长。剂量再增大时则出现胚胎死亡，此时由于有缺陷好的胚胎死亡，畸形率反而降低；剂量进一步增加则可造成母体死亡。致畸带

典型的致畸原的致畸作用剂量—反应曲线是很陡的，有时从“无作用”到胚胎死亡仅有2～4倍之差，如给予小鼠环磷酰胺5～10mg/kg未见畸形发生，而40mg/kg则可引起100%胚胎死亡。在“无作用”剂量到胚胎死亡剂量时，存在剂量带，称致畸带。如放线菌D的致畸带很窄，而脒基硫脲和反应停的致畸带特别宽。致畸带愈宽的致畸物，危险性愈大。此外剂量还可影响易感期，剂量愈大，常使易感期延长。作用时间

胚胎发育的不同阶段，对于致畸因子的感受性不同,呈现不同的敏感性器官有对致畸因子不同易感期

患风疹的孕妇，在不同时期感染，引起胎儿不同的先天畸形∶妊娠第4周

无脑儿和/或脊髓裂

第5周

无肢畸形第6周

先天性白内障

第5～10周

心脏缺陷

第6～9周

牙的畸形

第7～9周

耳聋器官有对致畸因子不同易感期

致畸作用由于外源化学物的干扰，胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现胚胎发育的不同阶段，呈现不同的敏感性遗传因子的影响不同种属与品系的动物对致畸原的敏感性不同动物的不同种属不同品系之间这种致畸作用差异，可能是由于它们对致畸物的代谢过程不同，胎盘构造亦有差异所致。其本质可能是遗传因素，即基因型的差异

环境污染与致畸先天性水俣病农药枯叶剂（2，4，5—T）环境激素引起的性机能异常电离辐射与致畸作用2，3，7，8—TCDD电离辐射与致畸作用

1945年日本广岛和长崎上空爆炸的二颗原子弹接受到爆炸辐射的孕妇所产生的种种畸形所证实。例如，日本的广岛遭到原子弹爆炸时，距离爆炸中心1200米的11名妇女，其中除4名由于有钢筋混凝土的原墙掩护而幸免辐射损伤，其余7名妇女所产婴儿全是畸形（小头），并伴有精神发育达缓。环境荷尔蒙引起的性机能异常

近二三十年以来，性机能障碍和疾病的发生率在世界各地以异常速度急剧上升。起初,引起人们关注的并不是“人”本身，而是自然界发生的动物突然变异现象。例如，美国佛罗里达州的湖泊，7年时间，生息的鳄鱼减少了90%，后经调查发现，在这儿栖息的鳄鱼与正常鳄鱼相比，生殖器萎缩变小的鳄鱼占到85%，并且在鳄鱼蛋的蛋黄里检查出了环境荷尔蒙的DDT和DDE成分

在日本沿海的海螺雌雄同体现象已经遍及全国，造成这种现象的原因是由于涂在船底和网上的涂料含有机锡化合物产生了污染。涂抹这种涂料的目的是为了杀死附着在船底和鱼网上的生物。此外，在美国五大湖水鸟雌雄同体现象，也是由于DDT污染所致。

由于受到环境荷尔蒙的威胁，而呈现世界性男性精子减少现象，已成为目前全世界新闻媒介渲染关注的大问题。据统计，本世纪50年代出生的男性的精子数为1亿/ml，70年代出生的男性减少到7500万个，以这种速度推测，90年代出生的男孩成人以后，可能减少到5000万个。1ml精液所含的精子数低于2000万个以下，便可能成为男性不育症，400万以下便是完全的男性不育症。舆论界惊呼∶按此速度发展下去，不出21世纪，全人类便会面临消亡的危机！造成恐龙消失的原因不是由恐龙本身造成的，而造成人类灭绝的原因恰恰是人类自身。与致畸作用有关的机理基因突变和染色体畸变生物合成的原料和能量不足

细胞毒作用酶的抑制对细胞膜损伤非特异性发育毒性作用

母体及胎盘的正常功能受到基因突变和染色体畸变

致畸胎物质进入母体到达胚胎，影响控制正常的生长发育方面的基因，使这种基因的控制偏离了正常的轨道，就会产生胎儿死亡、流产及先天性畸形。但是这种畸形并不具有遗传染色体畸变与基因突变的情况相似，可能有程度上的不同。一般认为它常导致胚胎死亡，如不死亡，也可产生畸形和功能障碍。自然流产的40%可见到染色体畸变，怀孕4周内自然流产中100%有畸形，其中75%有染色体异常。生物合成的原料和能量不足

现已证实水杨酸盐抑制粘多糖的合成，而粘多糖为结缔组织的主要成分，它的缺乏可导致畸形；EDTA与锌络合，可使胎儿锌水平下降；同样其它原因所致某些特殊营养成分，如镁、锰、叶酸、泛酸等缺乏，将导致畸形；RNA或DNA合成前体物不足，如嘌呤类、嘧啶类等以及蛋白质合成原料的不足，也可诱发畸形。细胞毒作用

在正常情况下，在器官发生期细胞增殖速度极高，如大白鼠妊娠第8～11天胚胎DNA含量增加可达1000倍。在此期间对外源化学物反应极为敏感，如接触一定剂量的外源化学物，可表现出细胞毒性作用。常见有细胞毒性的外源化学物有烷化剂、抗癌剂以及致突变物等。当接触剂量较低时，也可引起细胞死亡，但其速度和数量可被存活细胞的增殖所补偿，故在出生时并不表现畸形酶的抑制

细胞增殖、细胞分化及器官生长发育等过程均有酶参与。例如，DNA合成酶、RNA转录酶、核糖核酸酶以及碳酸酐酶等，它们在细胞分化增殖过程以及维持正常代谢中起着重要的作用。当这些重要酶类被抑制或破坏，将影响胚胎正常发育过程，并引起畸形对细胞膜损伤

在细胞膜正常结构以及渗透性等生物物理性质改变的情况下，也可出现畸形。大剂量的维生素A给予大鼠所致的致畸作用被认为是高浓度维生素A破坏了胚胎细胞膜的超微结构。细胞膜结构的正常及一定好的渗透压为维持细胞增殖及细胞代谢所必需，一旦受到损害，将影响细胞正常功能及增殖过程，导致畸形。非特异性发育毒性作用

非特异性发育毒性作用的特点是对全部胚胎组织细胞基本生命现象的干扰。例如，损伤线粒体功能、抑制线粒体呼吸和ATP的产生、抑制细胞色素氧化酶活性和降低细胞能量供给等。它与前述细胞毒性作用不同，不会出现靶部位或靶组织，也不可能有部分组织受损与畸形幼仔出生，它可使全部组织受到损害，引起胚胎全面生长迟缓，甚至胚胎死亡母体及胎盘的正常功能受到干扰

胚胎的正常发育与母体及胎盘的正常功能发挥有密切的联系。当母体必需的某种营养素如VA和叶酸的缺乏、营养失调如蛋白质和热能供给不足、营养成分由母体至胚胎的转运受阻、子宫和胎盘血液循环障碍等均可影响胚胎的发育，造成畸形甚至胚胎死亡和生长迟缓。发育毒性的评定方法致畸物体内筛检试验法传统常规致畸试验其它试验

1、全胚胎培养法

2、器官培养法

3、细胞培养法

生殖毒性和发育毒性三阶段一代试验法人群调查致畸试验（teratogenesistest）动物选择一般多采用大鼠、小鼠和家兔，其中以大鼠为首选剂量分组一般以LD50的1/3-1/2为最高剂量组，LD50的1/30-1/100为低剂量组。鼠类每组不少于15~20只，家兔7~8只。受试动物处理选择一批性成熟未交配过的雌鼠和雄鼠，按一雄一雌或一雄二雌比例，同笼过夜，次日清晨检查雌鼠是否受孕。发现阴栓或精虫，则表示受孕，查到日为孕期“0”天，次日为第一天