临床精液染色技术及形态分析

临床精液染色技术及形态分析

精子正常形态涂片的制作与染色每份新鲜的精液标本应制备2张以上的涂片。

每次取样前要充分混匀精液。

对于未稀释的精液，采用拉薄技术；对于已洗涤的精液，采用移液管法。要用铅笔做记号，记号笔会脱色。染色时2张涂片背靠背，使染色时间一致。用水冲洗已染色的涂片的力度和时间也要尽量一致。未经稀释的精液的涂片方法；（b）洗涤后的精子悬液的涂片方法。在精液液滴之前“拉”，而不要在液滴之后“推”精液涂片的厚度，影响因素有：液体的体积(10µl)…………体积越小，则精子分散越好拉片的角度(45°)…………角度越大，则涂片越薄涂片的速度(~1秒)…………速度越高，则片子越厚空气干燥的精液涂片，如果固定会出现的缺点：脱水——比湿片小剪切力——不成熟的精子头膨胀渗透损伤——胞浆小滴的丢失，过多的残余胞浆滞留推荐采用Papanicolaou、Shorr或Diff-Quik染色法。使用光学显微镜观察，精子头部顶体区为浅蓝色、顶体后区为深蓝色，中段略呈红色，尾部为蓝色或红色。残余的胞浆小滴染成粉红色或橙红色。

染色方法选择若采用人工分析精子形态，建议用巴氏染色法，涂片可以永久保存，符合质控要求。Diff-Quik染色法适合CASA，只有3个步骤，用时不足一分钟，但涂片不能保存。所以CASA必须能够保存每条精子的形态图片，而且要有图像回放功能才符合质控要求。Shorr染色法与巴氏染色的效果近似，步骤较少，涂片可以长期保存，适合人工分析。改良巴氏染色有20个步骤，耗时40-60分钟。脱色时间长短影响染色强度。染色背景较浅。Diff-Quik染色

有4个步骤，耗时1-2分钟。仅精子表面着色，对细胞膜影响小。背景较深。精子形态正常精子形态

精子头部长度为4.0-5.0um

宽度为2.5-3.5um

长宽之比为1.50-1.75

顶体界限清晰，占头部的40%-70%

中段稍细，宽度<1um,约为头部长度的1.5倍

尾部直，均一，比中段细，非卷曲，长度约为45um形态异常精子

1、畸形精子：头部畸形、中段偏厚、双尾

2、畸形精子：头部畸形、中段畸形

3、畸形精子：梨形头、中段弯曲、不规则、胞浆小滴过多

4、畸形精子：头部畸形

5、畸形精子：梨形头

6、畸形精子：头部畸形

形态异常精子

19、畸形精子：头部畸形、空泡数>2

20、畸形精子：头部正常、顶体>70%

21、畸形精子：头部畸形、顶体>70%

22、畸形精子：头部畸形、顶体<40%

23、畸形精子：头部畸形、顶体<40%

对于头部异常的描述对于颈和中段异常的描述对于主段异常的描述非精子细胞未评估精子精子多重缺陷的指标畸形精子指数（theteratozoospermiaindex，TZI)=缺陷总数/缺陷精子数。精子畸形指数（thespermdeformityindex，SDI)=缺陷总数/精子总数。TZI等于1表示每个异常精于只有一种缺陷，TZI等于3则表示每个异常精子都有头部、中段和尾部缺陷。所以，TZI反映的是每个精子的缺陷程度，是针对每个精子个体而言，而精子密度、活动率、前向活动率和正常形态以及SDI是就每一份精液的整体而言。畸形精子指数的数值介于1.00和3.00之间。以前的报道提示，"TZI>1.6与未经治疗不育夫妇的低生育率有关，而且SDI=1.6是体外受精失败的阈值。这些参数预示精子在体内和体外的功能情况。例：使用六键计数器每次计数200条精子。在第1次计数时，42条正常158条异常。在158条异常精子中，140条有头部缺陷，102条有颈部缺陷，30条有尾部缺陷，44条有多余的胞浆小滴残留。在第2次计数时，36条正常，164条异常。其中122条有头部畸形，22条颈部畸形，36条有多余的胞浆小滴。计算TZI时，用总的畸形数(140+102+30+44+122+108+22+36=604畸形)除以异常精子数(158+164=322),TZI=604/322=1.88；SDI=604/400=1.51。计算机辅助精子形态学计量分析的优势CASA的影像分析使精子形态学分析评估量化，能获得更多的精子特征参数。

自动分析系统比手工操作具有更好的客观性、精确性和可重复性，变异系数＜7%,甚至比熟练的操