荧光性假单胞菌抗性基因的筛选培训教材

荧光性假单胞菌

抗性基因的筛选实验背景荧光假单胞菌可产生10多种具有抗菌作用的

抗生性次级代谢产物

藤黄绿脓菌素【Plt】

硝吡咯菌素【Prn】2，4-二乙酰基藤黄酚【Phl】生物表面活性剂（环脂肽【CLP】、鼠李糖脂）

嗜铁素(水杨酸、绿脓杆菌螯铁蛋白、青脓素)

卵菌素A

氢氰酸

邻氨基苯甲酸随着生物工程技术的发展，从分子水平对藤黄绿脓菌素(Plt)、2，4-二乙酰基藤黄酚(Phl)、硝吡咯菌素(Prn)、环脂肽(CLP)等抗生性次级代谢产物的合成机制进行了深入研究，与其相关的功能基因已经被鉴定。本实验设计了针对特定基因的引物，利用PCR技术，筛选可以产生藤黄绿脓菌素(Plt)、2，4-二乙酰基藤黄酚(Phl)、硝吡咯菌素(Prn)、环脂肽(CLP)的荧光性假单胞菌二，荧光性假单胞菌菌种的活化1，在96孔板的每个孔中加入540μlLB培养基2，接入60μl甘油菌注意：这一步要做好记录，记清楚每个孔中接入的是那一株菌种注意：每一组学生接种一支阳性菌株Pf-53，将接过菌的96孔板置于28℃摇床过夜培养注意：96孔板需固定好，防止倾斜导致菌种交叉污染接种记录表格123456789101112APf-5BCDEFGH三，菌落PCR所用引物a.环脂肽CLP:(1)PGPRB-4965/PGPRB-4966(2)PGPRB-5045/PGPRB-5046b.2,4-乙酰藤黄酚Phl:Phl2a/Phl2bc.硝吡咯菌素Prn:Prnd1/Prnd2d.藤黄绿脓菌素Plt:PltC1/PltC2三，菌落PCRPCR体系:20ul灭菌去离子水15.2ul10×buffer2uldNTP0.8ul上游引物0.4ul下游引物0.4ulTaq酶0.2ul模板1ul以8个样品、1个阳性对照（Pf-5）

和1个阴性对照为例的MIX×10PCRH2O15.2ul152ul10×buffer2ul20uldNTP0.8ul8ul上游引物0.4ul4ul下游引物0.4ul4ulTaq酶0.2ul2ul在EP管中加入试剂后，分装入10个PCR管中，19ul/管，其中1管作为阴性对照，1管作为阳性对照，加入1uLPf-5菌液作为模版，剩下8管分别加入1ul模板

菌落PCR实验流程根据各组所做的模板数目计算mix，依次加入除模板之外的各试剂后混匀，离心，分装19uL入PCR管，对PCR管进行编号将活化好的菌液取100uL按照编号从96孔板分别移到1.5mLEP管中，盖紧盖子，置于沸水中煮10分钟。离心，各取1uL作为模板加入PCR管中将PCR管放入设好程序的PCR仪中运行四，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果1，配置1%的琼脂糖凝胶称取0.8g琼脂糖，加入80mL1xTAE缓冲液，置于电炉上煮沸3次，冷却至不烫手时加入40uL的EB染料，摇匀，倒入胶板。放置梳子（注意选择足够孔数的梳子）。静置30-40min待凝胶冷却。2，点样，电泳将凝胶移入电泳槽，电泳槽中应该有充足的1xTAE缓冲液。PCR产物中加入2uL10x上样缓冲液，混匀，离心。每孔依次点样4

uL，记录每孔点入的样品编号。每一块凝胶的一个孔需加入4

uLPf-5PCR产物作为对照。120V电泳30

min3，结果

凝胶成像记录电泳结果12—12—12—MprnphlpltPrn：786bpPhl：745

bpPlt：438

bp。CLPPGPRB-4965/PGPRB-4966360

bpPGPRB-5045/PGPRB-5046960

bp五，整理实验结果并进行菌种的保藏记录并整理PCR结果阳