流感病毒的核酸检测技术操作规范

流感病毒的核酸检测技术操作规范（一）流感病毒ConventionalonestepRT-PCR检测应用核酸检测技术为疑似流感病毒感染病例诊断提供依据，为流感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法。按照规定方法对标本和病毒进行处理和检测，保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。1.生物安全要求实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。季节性流感病毒生物安全二级，疑似高致病禽流感病例标本需在BSL-2级实验室操作，采取BSL-3级防护；核酸提取及加RNA模板可在BSL-2级实验室生物安全柜内操作；PCR反应体系配制在体系配制区；PCR产物检测在电泳区操作。2.主要试剂（所列厂家仅用作举例，实验室可自行选择）序号试剂名称货号规格生产商1One-stepRTPCRkit210212Qiagen2引物*（20μM)2ODTAKARA3RNaseinhibitorN2111Promega注：*引物序列详见表1。3.设备BSL-2生物安全柜；可调转速最大至14000rmp的离心机；涡旋混合器；10μL，100μL，200μL，1000μL量程移液器；PCR仪；电泳槽和电泳仪；凝胶成像系统。4.质量控制实验检测所需核酸提取试剂和一步法RT-PCR检测试剂不同批号之间需进行灵敏度的检测。同一试剂不同批次的灵敏度的检测至少半年一次。实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴性对照，阳性对照核酸事先应稀释分装，经Real-timePCR检测Ct值在30以内；阴性对照为DEPC处理水Real-timePCR检测Ct值为0。5.实验步骤实验注意事项由于PCR检测灵敏度高，因此必须采取一些预防污染的措施，以避免假阳性结果的出现，建议采取如下方法：核酸提取、反应液配制及检测反应进行应在独立的房间中进行。不同的房间配制相应的专用耗材和设备，不可交叉使用。配制反应液时，应穿着干净的实验服，带无粉手套进行操作。实验操作期间，如怀疑有污染，请更换手套。试剂及反应管的盖子应尽可能盖上。设备准备操作台的表面、枪头和离心机应保持洁净，可用5%漂白剂或其它清洁剂，如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面，以减少核酸污染的风险。试剂准备注意：配制反应液期间，尽量保持所有试剂放置在低温装置中，如预冷的冰盒。引物配制将新合成的引物在开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。用RNaseFreeWater溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100pmol/μL，即100μM。（例如：合成引物2OD，9.5nmol，则加水量为10×9.5＝95μL），可作为储存液。将100μM的引物浓度再10倍稀释，配成浓度为10μM，即可直接用于PCR反应。引物准备融化引物，振荡所有引物，短暂离心引物，然后放置在低温装置上。ConventionalRT-PCR试剂将RT-PCREnzymeMix放置在低温装置上，融化5×RT-PCRBuffer，颠倒混匀。短暂离心5×RT-PCRBuffer后放置在低温装置上。反应体系配制按照如下组分配制反应体系：组分体积（μL）5×RT-PCRBuffer5×n10mMdNTPMixture1×nRT-PCREnzymeMix1×nRNaseInhibitor0.1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×nRNaseFreeWater11.9×nTotal20×n将上述反应液混匀，分装到0.2mLPCR小管中，每管20μL，分别做好标记。加RNA模板（在核酸提取区）将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。一步法ConventionalRT-PCR反应将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR扩增，反应程序如下：温度时间（分钟：秒）循环数60°10：00142°10：00150°30：00195°15：00194°00：304050°00：3072°01：0072°10：0014°RT-PCR产物检测1.5％琼脂糖凝胶制备：称取1.5gAgarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料（GoldView）5μL，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶的温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×LoadingBuffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL-2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。电泳电压100V，约30～40min后看结果。将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。结果说明判读前提：阴性对照未扩增得到条带，阳性对照仅扩增得到特异性条带。阳性结果：根据各检测引物电泳时出现相应大小特异性条带，进行结果判断。阴性结果：未出现条带，或不在相应位置出现非特异性条带，均判为阴性结果。

表1.流感病毒One-StepPCR检测引物引物名称碱基组成说明FluA-M-F305’-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3’用于检测A型流感病毒M基因FluA-M-R2645’-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3’FluB-NS-F485

5’-GGGACATGAACAACAAAGATGC-3’用于检测B型流感病毒Ns基因FluB-NS-R9885’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’H1HA-F768

5’-ACTACTGGACTCTGCTGGAAC-3’主要用于检测季节性H1N1亚型流感病毒HA基因，也可检出部分甲型H1N1流感病毒HA基因。对疑似标本进行季节性H1N1亚型鉴定时，最好使用Real-timePCR方法进行检测，以免造成结果的误判。H1HA-R10945’-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3’N1-F10595’-AAGGGGTTTTCATACAGGTATGGT-3’主要用于检测季节性H1N1亚型流感病毒NA基因，也可检出禽流感H5N1亚型病毒NA基因及甲型H1N1亚型流感病毒NA基因。N1-R11655’-TCTGTCCATCCATTAGGATCC-3’H3HA-F6715’-ATCAGGGAGAGTCACAGTCTC-3’主要用于检测季节性H3N2亚型流感病毒HA基因H3HA-R9405’-ATGCTTCCATTTGGAGTGATGC-3N2-F779

5’-GGAAATCGTTCATATTAGCCCATTG-3’主要用于检测季节性H3N2亚型流感病毒NA基因，也可检测出部分禽流感H9N2亚型病毒NA基因N2-R9555’-AGCACACATAACTGGAAACAATGC-3’H5HA-F2485’-GTGACGAATTCATCAATGTRCCG-3’主要用于检测禽流感H5N1亚型流感病毒HA基因H5HA-R6475’-CTCTGGTTTAGTGTTGATGTYCCAA-3’AN1-F5805'-TGAAGTACAATGGCATAATAACWGACAC-3’主要用于检测禽流感H5N1亚型流感病毒NA基因，也可检测出部分甲型H1N1亚型流感病毒NA基因AN1-R9185'-CCACTGCATATATATCCTATTTGATACTCC-3’H9HA-F4265’-GAATCCAGATCTTTCCAGAC-3’主要用于检测禽流感H9N2亚型流感病毒HA基因，H9HA-R8085’-CCATACCATGGGGCAATTAG-3’AN2-F11215’-CGCTACGGTTATGAGACTTTCAG-3’主要用于检测禽流感H9N2亚型流感病毒NA基因AN2-R14015’-ATATTCGCCCCATCAGGCCATGAG-3’H7-F2455’-CCCAATGTGAYCAATTCCT-3’主要用于检测禽流感H7N7或H7N3亚型流感病毒HA基因H7-R4285’-GCTCCATTRGTTCTGATTCC-3’注：所列引物将根据流感流行情况不断进行更新。（二）流感病毒Real-timeonestepRT-PCR检测应用Real-timeonestepRT-PCR核酸检测技术为疑似流感病毒感染病例诊断提供依据，为流感病毒的型别和亚型的鉴定提供技术方法。按照规定方法对标本和病毒进行处理和检测，保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。1.生物安全要求实验室操作应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。季节性流感病毒生物安全二级，疑似高致病禽流感病例标本需在BSL-2级实验室操作，采取BSL-3级防护；核酸提取及加RNA模板可在BSL-2级实验室生物安全柜内操作；PCR反应体系配制在体系配制区；PCR产物检测在电泳区操作。2.试剂及耗材（所列厂家仅用作举例，实验室可自行选择）序号试剂名称货号规格生产商1AgPath-IDTMOne-stepRT-PCRkit4387424500次AB2引物*（40μM）2ODTAKARA3探针*（10μM）2ODTAKARA*引物和探针序列见表23.设备BSL-2生物安全柜；涡旋混合器；10μL，100μL，200μL，1000μL量程移液器；Real-timePCR仪；4.质量控制本实验检测所需AgPath-IDTMOne-stepRT-PCR试剂不同批号之间需进行灵敏度的检测。同一试剂不同批次的灵敏度的检测至少半年一次。实验检测除待检标本外还需设置阳性对照及阴性对照，阳性对照核酸事先应稀释分装，经Real-timePCR检测Ct值在30以内，阴对照为DEPC处理水，Real-timePCR检测Ct值为0。5.实验步骤实验注意事项由于Real-timePCR检测灵敏度高，因此必须采取一些预防污染的措施，以避免假阳性结果的出现，建议采取如下方法：核酸提取、反应液配制及检测反应进行应在独立的房间中进行。不同的房间配制相应的专用耗材和设备，不可交叉使用。配制反应液时，应穿着干净的实验服，带无粉手套进行操作。实验操作期间，如怀疑有污染，请更换手套。试剂及反应管的盖子应尽可能盖上。设备准备操作台的表面、枪头和离心机应保持洁净，可用5%漂白剂或其它清洁剂，如可以去除DNA酶的试剂擦拭台面，以减少核酸污染的风险。试剂准备注意：配制反应液期间，尽量保持所有试剂放置在低温装置中，如预冷的冰盒。引物和探针配制引物配制：将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。用RNaseFreeWater溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。探针配制：将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。用RNaseFreeWater溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。将100μM的探针10倍稀释，此时浓度为10μM，可作为工作浓度。引物和探针准备融化引物和探针（融化后的引物和探针在避光条件下，可在2℃-8℃下保存3个月,振荡所有引物和探针,短暂离心引物和探针，然后放置在低温装置上。Real-timeRT-PCR试剂将25×RT-PCREnzymeMix放置在低温装置上。融化2×RT-PCRBuffer，颠倒混匀。短暂离心2×RT-PCRBuffer后放置在低温装置上。反应体系配制按照如下组分配制反应体系，引物序列详见附录附表2,配制方法详见Real-timePCR引物制备SOP。组分体积（μL）2×RT-PCRBuffer12.5×n25×RT-PCREnzymeMix1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×n探针0.5×nRNaseFreeWater5×nTotal20×n将上述反应液混匀，分装到0.2mLPCR小管中，每管20μL，分别做好标记。加RNA模板（在核酸提取区）将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。一步法Real-timeRT-PCR反应将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR扩增，反应程序如下：96孔仪器SmartCyclerII循环数温度时间（分钟：秒）温度时间（分钟：秒）45℃10:0045℃10：00195℃10:0095℃15：00195℃00:1595°00：154060℃00:4560°00：60注：SmartCyclerII仪器升降温度设为1.6℃/秒；适用此反应条件的96孔仪器有AB7500，7900HT和Stratagene3500P.结果说明阴性对照反应得到的荧光曲线不应超过阈值线，应无Ct值或为Ct值为零。如果阴性对照产生假阳性则是说明有污染产生，此次检测结果无效，然后严格按照操作程序重复实验。阳性对照的检测结果应为阳性，且Ct值在20～30之间。如果阳性对照检测结果未达到要求，则需严格按照操作程序重复试验。当所有对照成立，检测标本在35个循环内出现荧光信号，则相应引物和探针阳性；若Ct值在35～40间，应重复确认，如Ct值还在40内可判断为阳性；Ct值超过40，视该样本为阴性。所有的临床标本RNP检测都必须为阳性，且Ct值在35.0以内才足可以证明样品的质量是可接受的。如果临床标本RNP检测为阴性，则可能是以下原因：临床样本核酸提取不正确导致RNA的丢失或临床标本里存在大量的RT-PCR反应抑制剂。样品中人细胞成分太少，以至于不能检测到。反应液配制错误或程序设置错误。试剂或仪器失灵。

表2.流感病毒检测引物和探针序列引物/探针名称碱基组成FluA-Forward5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’FluA-Reverse5’-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3’FluA-probe5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3’H1-F2475’-AACATGTTACCCAGGGCATTTCGC-3’H1-R3615’-GTGGTTGGGCCATGAGCTTTCTTT-3’H1-P2785’-GAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGTTCAG-3’H3-F2935’-ACCCTCAGTGTGATGGCTTCCAAA-3’H3-R4005’-TAAGGGAGGCATAATCCGGCACAT-3’H3-P3845’-ACGCAGCAAAGCCTACAGCAACTGT-3’FluBForward5’-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3’FluBReverse5’-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3’FluBprobe5’-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-3’SWH1Fo