高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种PCR检测方法

PAGEI高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种PCR检测方法1范围本文件规定了高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种PCR检测的引物、仪器设备、试剂耗材、检测步骤、结果判定、防止交叉污染和废弃物处理的措施等。本文件适用于高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株的PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2102.1食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义SC/T7014水生动物检疫实验技术规范SC/T7015染疫水生动物无害化处理规程SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种high-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，PDD）是弧菌科发光杆菌属美人鱼发光杆菌（Photobacteriumdamselae）的一个亚种，广泛分布于全球海洋环境中，可以感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟、鲸豚类等不同的海洋动物。该菌种不同菌株因携带的毒力基因不同，对宿主呈现出高致病性、低致病性和无致病性。本文件界定的高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种是指感染宿主后能引起发病，最短可在1天内造成鱼类等宿主死亡并引发流行性疾病的菌株。4PCR引物4.1hlyB基因的特异引物正向序列hlyB-F:5'-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3'反向序列hlyB-R:5'-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3'4.2dly基因的特异引物正向序列dly-F:5'-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3'反向序列dly-R:5'-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3'5仪器设备和试剂耗材5.1仪器设备无菌操作台、台式离心机、恒温金属浴、PCR仪、漩涡振荡器、生物安全柜、微量移液器、核酸电泳仪、凝胶成像仪、高压灭菌锅等。5.2试剂耗材超纯水、2×PCRMix（含dNTP、Mg2+、DNA聚合酶）、SYBRGreenI染料、ROX参比染料、组织裂解液（含1%TritonX-100、2mMEDTA、20mMTris-HCl、0.2%SDS、20mM硫酸铵、1%甜菜碱）、琼脂糖（电泳级）、DNA分子量标准（DL2000Marker）等试剂。离心管、研磨棒、移液枪头、PCR管等耗材。6检测步骤6.1待检样品的核酸模板制备参照《SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术》和《SC/T7014水生动物检疫实验技术规范》的相关规定，检查待检病样的外观症状，并在无菌操作台中对主要病灶部位进行无菌取样。随后剪取0.1g~0.2g病灶部位的组织样品置于1.5mL离心管中，用研磨棒研磨，加入200μL组织裂解液和300μL灭菌的超纯水，充分振荡混合均匀后，置于恒温金属浴上37℃保持5min~10min，使组织充分裂解（也可采用具有同等DNA抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒）。随后，用离心机8000rpm离心2min，获取上清液，吸取10μL上清液至一个新的无菌离心管中，并加入90μL超纯水对上清液进行稀释，振荡混匀后即作为待检样品的DNA核酸模板。6.2PCR反应体系的配置分别在200μL的PCR反应管中制作两个独立的20µLPCR反应体系。其中一个反应体系标记为体系A，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的hlyB基因正向序列引物2μL，10μM的hlyB基因反向序列引物2μL，制备好的DNA模板4μL，加无菌超纯水至总体积为20μL。另一个反应体系标记为体系B，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的dly基因正向序列引物2μL，10μM的dly基因反向序列引物2μL，制备好的DNA模板4μL，加无菌超纯水至总体积为20μL。分别在A、B两个反应体系中加入4μL6.1小节中制备好的DNA核酸模板，即完成PCR反应体系的配置。阴性对照反应体系以等体积无菌超纯水替代DNA模版。反应体系配置完成后，振荡均匀并瞬时离心后，迅速将反应管置于PCR仪中。6.3PCR扩增6.3.1PCR反应条件按照如下条件进行PCR反应：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火40s，72℃延伸20s，扩增40个循环。随后，保持72℃延伸10min。6.3.2PCR产物的电泳分别将体系A和体系B的10μLPCR反应产物，以及阴性对照的PCR产物点样于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。6.3.3结果观察将完成电泳后的琼脂糖凝胶转移至凝胶成像仪器中观察结果，并拍照记录。7结果判定7.1检测结果成立的条件体系A的PCR产物电泳后在344bp的位置上出现一条特异性条带，体系B的PCR产物电泳后在695bp的位置上出现一条特异性条带，两个体系的特异性条带需同时出现且阴性对照PCR产物电泳后均未出现条带（见附录A），则检测结果成立。否则，检测结果不成立。7.2结果判定7.2.1在检测结果成立的前提下，检测结果判定为阳性，即该样品为高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染。7.2.2如果被检测样品体系A中的PCR产物电泳后在344bp的位置出现一条特异性条带，但体系B中的PCR产物电泳后在695bp的位置没有出现特异性条带，且阴性对照PCR产物电泳后未出现条带，则该样品被美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染，但该菌株不具有高致病性。7.2.3如果被检测样品体系A中的PCR产物电泳后在344bp的位置、体系B中的PCR产物电泳后在695bp的位置都没有出现特异性条带，或者被检测样品体系A中的PCR产物电泳后在344bp的位置没有出现特异性条带，但体系B中的PCR产物电泳后在695bp的位置出现一条特异性条带，则该样品不是被美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染。7.2.4如果阴性对照的相应位置出现特异性条带，可能是阴性对照存在污染或是实验过程操作失误，无论体系A或体系B在相应位置是否出现特异性条带，均需再次重复进行检测。上述结果的判定标准可参见表1。表1检测结果的判定标准体系A（检测hlyB基因）体系B（检测dly基因）阴性对照结果判定++-样品被高致病性PDD感染+--样品被PDD感染，但不具有高致病性样品不是被PDD感染-+-+++检测失败，需重新进行检测+-+-++--+8防止交叉污染和废弃物处理的措施8.1为防止交叉污染所采取的措施应按照《SN_T2102.1-2008食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义》的相关规定执行。检测过程中产生的废弃物应按照《GB19489-2008实验室生物安全通用要求》的相关规定进行无害化处理。8.2被检测的病样样品在检测完成后应按照相关规定进行无害化处理。PAGE3附录A资料性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种不同毒力株PCR产物琼脂糖凝胶电泳图图1美人鱼发光杆菌美人鱼亚种hlyB基因的PCR产物电泳图1-25：不同来源美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株；26：阴性对照；M：DNA分子量标准。图2美人鱼发光杆菌美人鱼亚种dly基因的PCR产物电泳图1-2：高致病性的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株；3-25：低致病性或无致病性的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株；26：阴性对照；M：DNA分子量标准。附录B①PDD菌株的hlyB基因全长序列及用于本标准检测的部分序列（下划线部分，加粗斜体部分为检测用引物序列）ATGAATTTAAATCACTTAAGTATTAAGAAAAAACTGATCCTCGCCATGATCAGTGCGGTACTATTTTCTACTGCTCTTGTTGGTATTTTAAGCCAACAACAAGCACGAAAAGTCATTGAAACTCGCTTACTTGAATCGGAAATTCCTGCGACTTTGCTGCAGATTCGCAACCAAATCGATAAAGAAGTTTCCTTGTTGCAAGCAGCGGCACAACAACTGGCAACCAACCCATTAGTGATTGATTCACTCACCGCAACGCTGCCTCAAGATAACACCCAGCTCGTTACCTTACTTAACGAGATCAAGCAGCAATATCATCTATTTGATGCCTCTATTGCGGATCGAAATACAGGAAACTACTGGAACCAAGACGGTTTTTTACGCCAGCTTAACCACCAACAAGATAGCTGGTTCTACAACTTTGTCCGCAGTGGCAACGCTAAGATGCTCAATGTCTTTCGTGAAGCCAATGGTGATGTAAAACTGTTTGTTAATTACCAACAACTCAATGGTAAAGGGCTAGCTGGCTTGTCTAAATCGTTAGATGAAATGGTGCAATTTATTAATCAATTTAAACTTGAGCAAACTGGCTTTGTTTATCTGGTTGATGATAAAGGTATTGTGCGAATTCATAATGATAACCAGTTGATGGGAAAAGCAAGCTTAACCGATTTATACGGTAGCAAGGTGGCAAACCAACTGTTAAAACGAGGCAAAATCGAAATCGTGGATCTTGATCTTGCAGGCCAAGAAAATCTTGTTGCTTCAAGTTATATCCCAACGATGAATTGGTATGTCATCGCCCAATTACCTAAAAATGAAGCGTTTGCGAGCCTCAACCATGCCCGTAATCAAATTTTAATCTGGACTGCCATCATTGCGCTTGGCTTTACTGCGTTAGCGATTTGGCTTGCGAGCTCCATTACCCGTCCAATCGCTCGTTTAGCCGAAATGTTTAAAGATCTTGGTGAAGGTGAAGGCGATCTACGTCATCGTCTAGACATTCAAGGTAACGATGAAATTGCCCAACTGTCCCAAGGCTTTAATGGTTTTATTAGCAAAATCCATAATTCGGTAAAAGAAGTTGCGGAAACAGGAAATGCCCTACGTCACGCCTCTCAATCGGTAGCGGAACAAGCACAAACGACCTTAGATAACAGCCAAAGCCAACGCGATCGCACCATTCAAGTGGTAACCGCGATTAATGAGATGGGGGCAACCGTCAATGAAATTGCAGGTAATGCTGCTCAAGCCGCTGACGCCACTCACCTAGCAGAAACGGAAGCACAAAGTGGTCAACAGGTTGTTGGGCAAGCAAGAGAAACCATTTCACAACTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAGTGATTGAATCTTTGGCCCATAACACCCAAGCCATTGGCAGCATTTTGGATGTGATCCGTGGTATTTCAGAACAAACGAACTTATTGGCATTGAACGCAGCCATTGAAGCAGCTCGTGCTGGTGAGCAAGGTCGTGGTTTTGCCGTTGTTGCTGATGAAGTGCGCAGTCTTGCTAGTCGAACAGCGGCTTCAACTGATGAAATCCAAACTATGATCAACCGTTTACAGCAAGAGGCCAGCAATGCCGTAGCGGCTATCGAGCAAAGTCGCCTGTTAAGTTCCAATGGGGTTTCAGCCTCTGATGAAGCCAGCAGCGCATTGATTTCTATTGCCGAACGTATCACCTTAATTGCAGATATGAATACGCAAGTTGCAACGGCAACAGAAGAACAATCAACAGTGGTTAACGACATCAACTGCAATATCGAAGTGATCAACGAAACCACTCAGCGTACAGCAACCACGGCCGAAGATCTTGCGCAAGCGAGCCTTGAACTGCAGCAATTATCTCACCGATTAGAAGTCATGGTTGGAAGCTTCAAACTTTAA②PDD菌株的dly基因全长序列及用于本标准检测的部分序列（下划线部分，加粗斜体部分为检测用引物序列）ATGAAAATAAAAACGCTTACTATGTTAATTGTGTGCTGCTCCTCAAATGCATATGCTTTTACACAATGGGGAGGTAGCGGTTTAACTCCTATGGGACATGAATGGTTAACGCGAGCCTCAGCTTTAGAGCTTCTTAATTCTGAGGATCTAATAAAGCCAGACCCAGAAGATCCTAGACTTAACTGGACACAAGGCCACGCAAAAAATTTAGATCTTGAAATAGCATCAAATGAAGTATCAAAAATAAAGAATCTAAAAAAAAGTGATAAGCTATACGAACCTAAATATGATGCTATTTTTTCTGCAATTGTTGGTGAACGATGGGTCGATATTGCTGGTTTTAATGTAATAGATGGCTTTATCGGTCAATATGGCCCAGATTGTTTTGATGCGACAGCACAAGAACCAGCAGATCTCCAGCAAGATCATTTCATGCGACGTTATGATGATATCGGAAGCCAAGGAGGCGTTTCTGCAGCAAAAAGAGCTCAAAATCGATTTATTGATCACTTTGTTAATGCTGCAATGGCAAATGAAAAAAGAATATTAGTATGGGATGGTGGAGCATCATCATCAACACAATCTGAAGTAGACTATAATTACTTCTTATTTGGACGAGCGGTCCATTTGTTTCAAGATTCATTTAGCCTAGAGCATACTGTTCGATTACCAGAAGATAATTATAAAAAAATTAGACAAGTCAAAGGATATATTTGTTCTGACAGTTCAGAACAGCATTCTCATAGCAGTTTTACTTCTTCTGATTTCTATGACTCTAATGATGTAATATGGAAGAAAAAATCAAAATCTGATACCGGATGGCAATCATATAAACCAAGTAATATGAAGCCAGCCGCTTTAACTGCACTAGAAGCAAGTAAAGATCTATGGGCTGCTTTTATAAGAACAATGGCAACAAATATTAATGAACGGGAAACTACAGCTAGAAAAGAGGCACAACAATTAATTGATACATGGCTATCTTTTGATGAGGAAGAAATGTTGTCATGGTATGAC