表面化学分析 表面表征 共聚焦荧光显微镜横向分辨的测量 征求意见稿

GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20151表面化学分析表面表征共聚焦荧光显微镜横向分辨的测量本文件描述了一种通过对尺寸比预期分辨小得多的物体成像来测定共聚焦荧光分辨的方法。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1点扩展函数pointspreadfunction成像系统对点光源或点状物体的响应。3.2横向分辨lateralresolution在样品表面平面内或在与图像形成光学器件的轴线成直角的平面内能可信区分成分变化所对应的测量距离。4符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本文件。APD：雪崩光电二极管（avalanchephotodiode）CFM：共聚焦荧光显微镜（confocalfluorescencemicroscope）FWHM：半高峰宽（fullwidthathalf-maximum）LSCM：激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope）NA：数值孔径（numericalaperture）OL：物镜（objectivelens）PMT：光电倍增管（photomultipliertube）PSF：点扩展函数（pointspreadfunction）QD：量子点（quantumpoint）5概述GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:201525.1背景信息度，因此空间分辨可以得到提高[2]。像相比，根据荧光波长所形成的图像具有更好的对比度，且在一张图像中进行多色成像也是可能的。处理。通过CFM对薄膜或纳米级物体进行成像和化学分析的过程中，当物体轴向尺寸明显小于CFM轴向分辨的典型数值时，横向分辨尤为重要。不同的制造商常用不同的方法来表征仪器的空间分辨。本文件提供了一种测量CFM仪器横向空间分辨的方便、有效方法，它适用于非专业操作者使用。本文件中的术语和分析程序符合ISO18516[3]。5.2CFM的操作类型5.2.1概要这里根据样品的激光聚焦扫描技术来描述不同操作模式的CFM。本文件的主要对象为台式扫描CFM和激光扫描CFM。5.2.2台式扫描CFM由于CFM中涉及的光学器件是静止的，因此光路简单且几乎不需要维护。光学准直过程中的像差或漂移被最小化。扫描区域的大小只受样品扫描台的机械运动的影响，因此可以进行大面积扫描。精细单元进行成像。5.2.3激光扫描CFM此保持了样品的状态。限，且扫描区域的大小还取决于物镜的放大倍率。在这种情况下，优先使用具有高NA（具有较好的采集效率和较高的分辨）的低倍物镜（具有较大的扫描区域）。5.2.4转盘式CFM高速转盘会涉及多个激光焦点和共轭探测器针孔。5.3影响CFM横向分辨的参数5.3.1概要通过测量CFM的PSF横向尺寸来评估横向分辨。光学显微镜空间分辨的理论极限为：GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20153阿贝分辨X,Y=λ/2NA和阿贝分辨Z=2λ/NA2相关参数的全面综述和确定PSF尺寸的实验方案可通过文献[2,5~7]获得。5.3.2物镜激光聚焦尺寸和采集体积取决于物镜（OL）的NA，因此物镜对CFM图像的横向分辨有直接影响。5.3.3探测针孔的尺寸和镜筒透镜的焦距探测针孔的最佳尺寸须由操作人员来酌情选择。由于探测针孔经镜筒透镜和OL在样品平面上的成像尺寸比其实际尺寸更为重要，因此也宜对OL和镜筒透镜的放大倍率进行规定。5.3.4激光照明光束的准直和纯度只要照明光束经准直且填充OL的背孔，就可能达到OL的预期性能。5.3.5激光照明的偏振性输入激光的偏振性会影响PSF的形状和尺寸。线性偏振光照明会沿着偏振方向拉长PSF[8]。5.3.6激发和发射波长发射波长不同于（大于）激发波长，它会降低分辨[2]。5.3.7图像对比度为了准确测量横向分辨，要求CFM图像具有好的对比度。影响CFM图像对比度的经验因素包括光学器件的清洁度、信号强度、噪声、光电探测器的灵敏度、光路的通量和光束偏振性等。6通过对小尺寸物体成像来测量横向分辨6.1背景信息可通过对一个非常小的物体成像来估算CFM的横向分辨。由于可从单一的CFM图像中获得直接显由于小物体的有限尺寸对其在CFM图像中所观察到的尺寸有贡献，因此所观察到的图像代表了PSF和荧光纳米颗粒。图1给出了通过CFM测量荧光珠以及提取用于估算FWHM的谱线轮廓的示意图。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20154图1获得的荧光图像及用于估算CFM仪器横向分辨的单个荧光珠横截面轮廓的FWHM6.2样品选择和样品要求如果荧光纳米颗粒的尺寸与CFM的PSF的尺寸相当，则需要一去卷积过程来推导显微镜的实际于300nm的PSF，典型PSF尺寸的四分之一为75nm，这表明能使用75nm的纳米颗粒作能通过其它高分辨显微镜来获得，如原子力显微镜和电子显微镜。中进行超声清洗，然后再用H2O进行清洗，等离子体清洗同样有效[10,11]。6.3仪器运行前的参数设置通过CFM获得的图像质量取决于操作者的技能和实验参数。在给定的参数设置下，不同的操作者件并不强制要求在操作CFM仪器时使用特定的实验参数。与之相反，操作者可根据自己的决定选择合适的实验参数来优化CFM成像。这些参数包括但不限于激发激光的波长和光束质量、照明光束的偏振分之一，也就是说，横向分辨的数值范围宜定义为至少5个像素[3,4]。6.4数据采集和分析6.4.1选择合适的光斑有所不同，典型的程序如下：1)开启激光，确保通向样品的光路畅通，且所有光学器件都安装到位。2)安装可获得的具有最高NA的物镜。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:201553)将制备好的样品置于显微镜载物台上，通过目镜或相机显示器观察，使其紧密聚焦。4)转动或调整必要的滤光器轮或分束器，使得从样品表面反射的激光能被光电探测器探测到。5)在监测光电探测器输出的过程中，在最小的激光功率条件下调节OL与样品之间的距离或探测针孔的位置（若可调），使得光电探测器的输出最大化，从而实现对聚焦的微调。6)在仍能提供好的图像对比度的前提下，使用探测针孔的最小尺寸。这一步骤主要取决于操作者的判断。7)精细聚焦后，插入长通滤光器或控制计算机，使得阻挡激光进入光电探测器的长通滤光器就位，提高激光功率。8)若所用仪器能以线扫描方式实时监测光电探测器的输出且样品是高度荧光的，则能通过监测荧光光强和使用长通滤光器来调整焦点和针孔位置，以尝试改善聚焦和准直。9)确定扫描方向、图像大小、像素数和扫描速度（或像素驻留时间）。10)进行成像并保存数据用于分析。测量FWHM。在选择亮斑时，应符合以下条件：1)亮斑应是孤立的且不与相邻的斑点重叠。建议对仪器进行检查。6.4.2通过谱带平均处理提取谱线轮廓为了获得单个光斑轮廓的代表性FWHM，应使用谱带平均处理方法。首先选择由多条（至少5条）成线条得到的。图2给出了在单个荧光光斑上进行谱线轮廓谱带平均处理的过程。谱带应沿着微珠轮廓的短轴和长轴方向选择。为了用于FWHM的估算，得到的谱线轮廓应满足以下两个条件：1)谱线轮廓的总长度宜至少是预期分辨的5倍[3]。也是用于估算横向分辨的横截面轮廓两侧平台的峰高之间的最大变化值。图2提取用于FWHM估算的代表性谱线轮廓的谱带平均处理6.5数据记录测得的PSF的FWHM直接受OL和激光激发和探测波长的影响，因此只有在正确描述这些实验参数时，横向分辨才有意义。应提供的其它相关参数包括：a)CFM的操作类型：台式扫描或激光扫描。b)OL的规格：空气、油浸、水浸、NA和放大倍率。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20156预计针孔尺寸是一个可供选择的参数，它可在此说明。d)激发波长和探测波长。e)输入光的偏振态。f)样品上激光焦点的功率。g)样品描述：用于成像的纳米颗粒或QD的已知尺寸。h)图像区域的大小，单位为μm。i)x和y方向上的像素数。j)快速扫描方向。k)用于测量横向分辨的谱线轮廓的信噪比。l)CFM图像中单个颗粒在x轴和y轴的FWHMs。GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20157样品制备与数据和分析示例A.1样品制备这里介绍了使用荧光纳米珠作为测试样品来测量CFM横向分辨的一个示例。只要颗粒能被近似为一个点光源，则任何类型固定在平面基底上的纳米米颗粒的横向尺寸不宜超过预期分辨的四分之一。颗粒。基底的清洁程度非常重要，它可用Piranha溶液[6]进行清洗，也可在碱性的1MKOH溶液中进行超声清洗，然后再用H2O进行清洗，等离子体清洗同样有效[7,8]。制备样品的实际操作步骤如下：进行清洗。2)KOH浸泡时间为30min，丙酮和水清洗时间分别为15min；KOH溶液可溶解附着在载玻片上的无机物，丙酮可去除有机物，最后用水清洗掉载玻片上的所有物质。3)重复步骤2）2~3次后，利用空气轻轻吹干载玻片。5)通过旋涂（5000rpm、60s）分别下，使用稀释200000倍的悬浊液得到的样品通常每100μm2上有几十个颗粒。A.2数据采集和分析这里采用德国Witec公司生产的Alpha300型CFM对6.1详细的获取颗粒图像的实验程序如下：行优化。测器，从而显著提高图像的对比度。该芯的尺寸相当于2倍的艾里斑。5)通过激光扫描样品台实现对样品的光栅扫描，获得CFM图像。图A1给出了沿着x和y方向进行谱带平均处理得到的同一GB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20158图A.1同一光斑的谱带平均谱线轮廓A.3数据记录表A.1数据记录示例488nm样品处为（2~3）μW5μL黄色荧光珠（Invitrogen公司）水溶液旋涂在载玻直径约20nm60×60pixelsx轴0.33Hz（242.2±3.8）nm（242.1±3.8）nmGB/TXXXXX—XXXX/ISO18337:20159[1]ISO18115-1,Surfacechemicalanalysis—Vocabulary—Part1:Generaltermsandtermsusedinspectroscopy.[2]STELZERE.H.K.Contrast,resolution,pixilation,dynamicrangeandsignal-to-noiseratio:Fundamentallimitstoresolutioninfluorescencelightmicroscopy,JournalofMicroscopy,v189(1998)pp.15-24.[3]ISO18516,Surfacechemicalanalysis—AugerelectronspectroscopyandX-rayphotoelectronspectroscopy—Determinationoflateralresolution.[4]WILKENINGG.&KOENDERSL.Nanoscalecalibrationstandardsandmethods.Chapter21.Wiley-VCH,2005.[5]COLER.W.,JINADASAT.,BROWNC.M.Measuringandinterpretingpointspreadfunctionstodetermineconfocalmicroscoperesolutionandensurequalitycontrol,NatureProtocols,[6]ZUCKER,R.M.ConfocalMicroscopy.MethodsandProtocols.EvaluatingConfocalMicroscopySystemPerformance.Springer,2006.[7]MURRAYJ.M.,APPLETONP.L.,SWEDLOWJ.R.,WATERSJ.C.Evaluatingperformanceinthree-dimensionalfluorescencemicroscopy.JournalofMicroscopy,v228(2007)pp.390-405.[8]KIMJ.,KIMD.C,BAEKS.H.Demonstration