海马齿NHX家族成员鉴定和逆境胁迫后表达分析

海马齿NHX家族成员鉴定和逆境胁迫后表达分析目录TOC\o"1-3"\h\u22463第一章引言 页摘要：海马齿（SesuviumportulacastrumL.）是番杏属的草本植物主要生长在靠近海岸的地区，其功能丰富如可以巩固靠海岸的沙滩避免形成沙尘污染，在海水中可以正常完成其生活史也可以作为鱼类的避阳场所，具有很强抗逆性主要耐盐。Na+/H+逆向转运蛋白（Na+/H+exchange，NHX）是耐盐植物的关键基因其表达有助于植物进行在耐盐胁迫下正常生长，为探究NHX在海马齿面对重金属镉胁迫下的作用，对海马齿NHX基因家族进行其成员鉴定和其功能的初探。方法采用生物学基础信息分析的方法从海马齿转录组数据中调取NHX基因家族序列，并对调取的信息数据进行蛋白的系统发育树分析、多序列比对分析、跨膜结构域分析和保守基序分析，实时荧光定量PCR研究重金属镉胁迫下NHX成员的相对表达量。本实验结果为：从海马齿的全长转录组中鉴定出42个NHX基因。其中氨基酸为：244~1232aa、分子量大小为26.7~132.58kD、等电点为4.67~9.56、不稳定指数为22.64~52.18、其中海马齿SpNHX16、SpNHX18、SpNHX24、SpNHX26、SpNHX28、SpNHX29、SpNHX30、SpNHX31、SpNHX32蛋白为亲水性蛋白。其余SpHNX蛋白为疏水性蛋白。荧光实时定量PCR结果为，重金属镉胁迫下四个SpNHX基因在根和叶的表达量各有不同，随着镉胁迫时间的延长，除了海马齿NHX30在根部的表达量在总体表现上有微小上调趋势外，其余海马齿NHX30在叶片、NHX7在根部和叶、NHX31在根部和叶、NHX32在根部和叶基因的表达量总体都表达出下调趋势。本实验的结论为，NHX基因家族对于镉胁迫并不敏感，而且大多数成员在镉胁迫中没有表现出显著的表达升高。为海马齿NHX家族基因的克隆及功能预测提供了一定的理论参考。关键词：海马齿；镉胁迫；NHX基因家族；基因鉴定；生物信息学分析第一章引言1.1研究背景据2014年《全国土壤污染状况调查公报》报道，在我国土壤情况已经严重影响到生物的正常生长发育，其中的一些地区的土壤中重金属镉的含量已经严重高于规定的含量达到7%让大多数的生物面临无法生存的困境。REF_Ref31958\r\h[1]被污染的土壤中主要是农业用地、草地和林地等经济类用地对经济形势造成严重的威胁处理土地当中的镉污染迫在眉睫。重金属含量超标对人体危害极大，会导致肾功能损坏和软骨症等。镉在自然界当中存在的方式为锌共生物或是铅共生物，被污染的土地会无法难以进行耕种，种植出的植物一旦食用就可能出现上述症状，从而影响生物的多样性会导致生态系统的完整性遭到破坏。镉是工业生产中的主要原料之一，随着我国工业快速发展土地、水体中的镉含量已经出现超出正常数值的情况，环境已经面临严重的重金属污染。耕地因镉污染导致产量急剧减少，水体中的镉污染会导致水生生物无法正常地生长发育，镉污染已经对现代生活和经济发展造成严重的不良影响。如何解决重金属镉污染的问题已经成为世界各地科学家研究讨论的问题之一。已经有科学家提出了一些处理镉污染的方法主要包括物理方法，化学方法和生物改良法，面对镉污染土壤的物理修复方法主要有排土、客土、深耕翻土等传统物理方法以及电修复技术、洗土法等，客土法就是将污染土壤铲除，换入未污染的土壤，去表土法就是将污染的表土移去等，传统的物理修复方法治理镉污染效果非常明显。REF_Ref32086\r\h[2]但这一种处理方法对资源和人工的要求极高，不仅如此将不同地区的土壤相互混合会导致原有的土壤生态环境发生变化，会使土壤生态环境遭受严重破坏。物理修复无法从根源上解决土壤镉污染问题。化学法是指通过在土壤中施用化学制剂、改良剂，增加土壤黏粒和有机质，改变土壤氧化还原电位和pH值等理化性质，使土壤镉发生氧化还原等作用，降低镉的生物有效性，以减轻对其他生物的危害。REF_Ref32556\r\h[3，REF_Ref32563\r\h4]使用化学试剂对土壤进行改良可能会引起一些对土壤不良的副作用。相比较之下，生物改良法是一种长期有效的并且还不会破坏生态环境的良好方法。但是土壤当中镉含量过高导致大多数植物都无法正常生长，更无法说明其能优化土壤降低其的含重金属量。因此说明研究在镉胁迫下正常完成生活史的植物的生化机理和基因调控具有重要价值和意义。1.2海马齿研究进展1.2.1海马齿简介海马齿为番杏科海马齿属的草本植物，是盐生植物。主要分布在全年高温，季节变化小，温差很小的地区。我国海南岛的沿海地区，有广泛的生长。REF_Ref196\r\h[5]海马齿可以长时间在海水和淡水条件下正常生长，而非盐生植物在海水中无法正常生长。海马齿的特性表现为：海马齿可以在高盐度的土地和水中完成其生活史；可以收集被污染的环境中的污染物；可以抵抗高温、适应不良的土壤和水体。REF_Ref235\r\h[6]海马齿可以在较极端的环境完成其生活史，因此本实验将海马齿作为镉胁迫的研究对象。1.2.2研究现状生物生存的环境当中并不是完全相同的，有的地区的生存环境当中还存在不利于植物生长发育的因素，植物为了能生存在各种各样的胁迫环境中便在漫长的进化过程中形成了依靠植物组织和体内各种分子、生物活性物质、生物化学反应来抵抗、顺应不利环境。REF_Ref784\r\h[17]虽然现如今对于阐述逆境对植物造成的危害和植物抗逆机理的文献和报道并不完整，但在遗传、细胞、生理生化等方面对抗逆机理的研究已经有了显著的进展，如将已知的逆境相关基因导入作物中因此提高了作物的抗逆性有利于作物的生长发育，有利于环境的保护和农作物的产量提升，进而来说研究和探索新的抗逆蛋白依旧是植物抗逆性研究的重点之一。REF_Ref830\r\h[18]镉的胁迫会导致植物的生长发育受到抑制并且会随着镉浓度的增加抑制的强度也跟着增强，最终会导致植物的死亡。REF_Ref862\r\h[7]NHX是细胞中Na+（K+）/H+的逆向转运蛋白，具有保守的Na+/H+交换结构域，属于单价阳离子/质子反转运蛋白1（MonovalentCation:ProtonAntiporter1，CPA1）超家族，主要利用H+-ATP酶和H+-PPase形成的两个质子泵，产生H+电化学梯度，将Na+从细胞质转运到液泡或是细胞外，从而稳定Na+的稳定性，减轻Na+在细胞内的积累所产生的毒性作用。REF_Ref911\r\h[8-REF_Ref951\r\h12]位于植物液泡中的NHX在离子稳态和耐盐性中起重要作用。REF_Ref1202\r\h[13-REF_Ref1209\r\h15]NHX具有维持细胞膨压、Na+（K+）浓度、膜囊泡运输和调节细胞内pH稳态的功能，是与植物耐盐相关的关键因子之一。REF_Ref1398\r\h[16]总而言之，目前对于海马齿NHX家族的功能还未完全挖掘，本实验采用重金属镉胁迫进行对海马齿功能的探究。这研究对于海马齿的耐重金属镉的机理和海马齿的功能探究有着重大意义。1.3本研究的目的和意义随着全球经济的快速发展，工业化的发展也得到快速地提升。但是产生的工业废弃物数量众多，部分工厂为了自身的经济效益选择将废弃物直接排入周围的环境当中导致环境生态遭到严重的破坏。植物受到生存环境的胁迫影响，因此如何提高植物应对环境变化的能力变得十分重要这与生态环境的稳定有着密不可分的关系。通过转基因技术将胁迫蛋白的相关基因转入植物就为解决这类问题提供了一条可行的道路。重金属污染是农业生产和生态环境保护中面临的严重问题，因此深入研究植物对镉等重金属的耐受性的生理和分子机制在实践和理论方面都有着重要的价值和意义。不同的植物在面对镉胁迫时所相应的机制各不相同，而对于同一植物，用相同胁迫条件处理不同的时间导致胁迫蛋白的表达量也有所差异。第二章海马齿NHX基因家族鉴定2.1实验方法2.1.1海马齿基因转录组中鉴定NHX家族通过阅读已有的NHX基因家族的相关报道得知，拟南芥（ArabidopsisthalialaHeynh）有8个AtNHX基因成员然后在拟南芥基因组数据库中的搜索引擎（/）找寻这8个基因的蛋白序列、桃（PrunuspersicaBatsch）有7个PpNHX基因成员同上述的方法从桃的基因组数据库（/gdr/）中搜索上述成员的蛋白序列，在NCBI中下载海马齿全长转录组数据。下载使用本地blast-2.4.+（/blast/executables/blast+/LATEST）对上述数据进行处理分析，以进行海马齿NHX家族的鉴定工作。利用expasy（/protparam/）对搜寻出的基因进行理化性质的分析。使用TMHMMServerv2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）预测跨膜结构域。2.1.2海马齿NHX蛋白的系统发育分析使用MEGA11对从blast搜索的海马齿（Sesuviumportulacastrum，Sp）的NHX蛋白序列、从拟南芥基因组数据库搜寻的拟南芥（Arabidopsisthaliana，At）NHX蛋白序列和从桃的桃基因组数据库搜寻的桃（Prunuspersica，Pp）NHX蛋白序列利用ClustalX2.1使用完全比对的方法进行多序列比对，采用最大似然法（MaximumLikelihood，ML）构建系统发育进化树，Bootstrap值设为1000。使用PS软件对系统发育树进行美化。2.1.3海马齿NHX蛋白的保守基序分析使用MEME（/meme/tools/meme）分析找寻的海马齿NHX蛋白的保守基序，在软件内将输出值设置为10，其他的数据采用默认值。然后填写好可以接受数据的邮箱，等待系统运行完毕就会在邮箱中收到结果，最后将得到的海马齿NHX的保守基序进行美化。2.2实验结果与分析2.2.1海马齿NHX基因家族鉴定将搜寻到的桃NHX基因的蛋白序列和拟南芥NHX基因的蛋白序列整合后，利用blast-2.4.+在海马齿转录组的全长序列中找到42个海马齿NHX基因（表1）。本实验将其命名为SpNHX1~SpNHX42，经过理化性质得本次找寻的NHX基因的氨基酸的长度在244~1232aa；蛋白质的分子量在26.7（SpNHX12）～132.58（SpNHX24）KD；其中最大的等电点是SpNHX32的9.56，最小的等电点是SpNHX12的4.67；SpNHX的不稳定指数在22.64~52.16，其中SpNHX6、SpNHX7、SpNHX8、SpNHX9、SpNHX10、SpNHX11、SpNHX13、SpNHX14、SpNHX15、SpNHX16、SpNHX18、SpNHX22、SpNHX24、SpNHX25、SpNHX26、SpNHX28、SpNHX29、SpNHX30、SpNHX31、SpNHX32、SpNHX33、的不稳定指数过大，其余的海马齿SpNHX蛋白的稳定指数在合理范围内。海马齿SpNHX16、SpNHX18、SpNHX24、SpNHX26、SpNHX28、SpNHX29、SpNHX30、SpNHX31、SpNHX32蛋白为亲水性蛋白。表1海马齿NHX蛋白的理化性质基因IDGeneID基因名称Genename氨基酸数Numberofaminoacids分子量Molecularweight(KD)等电点pI亲水性Grandaverageofhydropathicity不稳定指数Instabilityindextranscript_HQ_SP_transcript179451/f1p0/2561NHX15547735.77transcript_HQ_SP_transcript116830/f1p0/2584NHX25547735.77transcript_HQ_SP_transcript59525/f1p0/2697NHX35547735.77transcript_HQ_SP_transcript227348/f1p0/2571NHX45547935.07transcript_HQ_SP_transcript27679/f1p0/2576NHX55547935.07transcript_HQ_SP_transcript13019/f8p0/2017NHX654660.446.420.50640.68transcript_HQ_SP_transcript224745/f1p0/1971NHX754660.446.420.50640.68transcript_HQ_SP_transcript28696/f1p0/2168NHX852858.355.460.44550.65transcript_HQ_SP_transcript171893/f1p0/1991NHX950455.575.720.44248.99transcript_HQ_SP_transcript140398/f1p0/2071NHX1037341.275.460.29246.58transcript_HQ_SP_transcript143758/f1p0/2040NHX1130533.626.190.38744.67transcript_HQ_SP_transcript187653/f1p0/1692NHX1224326.704.670.93735.26transcript_HQ_SP_transcript676/f2p0/4108NHX131155127.896.040.06841.01transcript_HQ_SP_transcript212466/f1p0/4068NHX1411555342.21transcript_HQ_SP_transcript1175/f2p0/3783NHX151139126.386.020.06540.29transcript_HQ_SP_transcript93973/f1p0/3282NHX1682191.996.29-0.15543.44transcript_HQ_SP_transcript60265/f1p0/3895NHX1770077.405.790.36933.91transcript_HQ_SP_transcript113099/f1p0/4843NHX1869978.816.25-0.3850.77transcript_HQ_SP_transcript91869/f1p0/1884NHX194284539.52transcript_HQ_SP_transcript54801/f1p0/1783NHX204284539.52transcript_HQ_SP_transcript208293/f1p0/1857NHX2142847.266.140.45539.72transcript_HQ_SP_transcript87814/f1p0/3267NHX2279184.468.950.541.08transcript_HQ_SP_transcript210668/f1p0/4469NHX231230132.295.080.01939.61transcript_HQ_SP_transcript208198/f1p0/4521NHX241231132.574.99-0.00242.66transcript_HQ_SP_transcript93969/f1p0/4258NHX251042111.944.870.11342.3transcript_HQ_SP_transcript192129/f1p0/4283NHX26978105.715.04-0.0341.49transcript_HQ_SP_transcript204225/f1p0/2542NHX2747650.648.890.73133.07transcript_HQ_SP_transcript121008/f1p0/3361NHX2885094.168.81-0.72452.18transcript_HQ_SP_transcript3708/f2p0/3071NHX2981189.988.69-0.70951.91transcript_HQ_SP_transcript98884/f1p0/3064NHX3082591.458.69-0.69151.58transcript_HQ_SP_transcript3628/f2p0/3092NHX3181690.628.71-0.7350.7transcript_HQ_SP_transcript76765/f1p0/1986NHX3245149.839.56-1.02648.94transcript_HQ_SP_transcript71242/f1p0/3038NHX3333036.609.420.39850.23transcript_HQ_SP_transcript153860/f1p0/3489NHX3477786.006.690.3431.53transcript_HQ_SP_transcript163877/f1p0/3359NHX3577786.036.840.34430.23transcript_HQ_SP_transcript117343/f1p0/2254NHX3658463.755.610.5931.02transcript_HQ_SP_transcript156480/f1p0/1904NHX3744147.818.380.94829.13transcript_HQ_SP_transcript131172/f1p0/2495NHX3859063.685.660.62127.32transcript_HQ_SP_transcript211693/f1p0/2426NHX3959063.685.660.62127.32transcript_HQ_SP_transcript120207/f1p0/1904NHX4042745.577.231.06128.75transcript_HQ_SP_transcript6542/f2p0/2665NHX417786636.66transcript_HQ_SP_transcript70996/f1p0/2114NHX4229030.884.930.66622.622.2.2海马齿NHX蛋白的系统发育分析通过利用拟南芥（ArabidopsisthalialaHeynh，At）8个NHX基因、桃（PrunuspersicaBatsch，Pp）7个NHX基因及海马齿（Sesuviumportulacastrum，Sp）NHX家族42个NHX基因的蛋白序列构建了系统发育树（图1），根据进化分析可以分为七个亚组。Ⅰ亚组中包含SpNHX（6、7、12、26、27、28），Ⅱ亚组包含SpNHX（18、24、30、31、37、38、41、42），SpNHX16属Ⅳ亚组。由此可以看出NHX基因家族成员之间进化的方向存在一定差异。图1NHX蛋白的系统发育关系Fig.1PhylogeneticrelationshipofNHXproteins2.2.3海马齿NHX蛋白的保守基序分析通过在线软件MEME分析SpNHX蛋白序列保守基序（图2）。从图3可以看出，不同SpNHX的Motif数量相差较大，为3～9个。SpNHX1、SpNHX2、SpNHX3、SpNHX4、SpNHX5均含有Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif6、Motif7、Motif8，说明这7个基序在SpNHX（1、2、3、4、5）蛋白具有高度保守性。图2海马齿NHX蛋白保守基序分析Fig.2ConservedmotifanalysisofNHXproteinsinSesuviumportulacastrum2.2.4海马齿NHX蛋白的多序列比对利用ClustalX2.1对从blast调取出的四十二条海马齿NHX蛋白序列进行多序列比对使用完全比对的方法进行分析比对（图3）。图中红线框为保守结构域图3海马齿NHX蛋白多序列比对分析Figure3Multi-sequenceanalysisofNHXproteininSesuviumportulacastrum2.2.5海马齿NHX蛋白跨膜结构分析使用42个SpNHX的蛋白序列在蛋白跨膜结构域预测的网站进行分析（图4），在海马齿的SpNHX中有35个存在多个跨膜结构域，有7个NHX蛋白不含跨膜结构域（SpHNX41、SpHNX32、SpHNX31、SpHNX30、SpHNX29、SpHNX28、SpHNX18）。在含有跨膜结构域的SpNHX蛋白中，也各有不同SpNHX13、SpNHX14、SpNHX15、SpNHX17、SpNHX22、SpNHX23、SpNHX27含有12个跨膜结构域，SpNHX1、SpNHX2、SpNHX3、SpNHX4、SpNHX5、SpNHX36、SpNHX38、SpNHX39含有11个，SpNHX6、SpNHX7、SpNHX8、SpNHX9、SpNHX24、SpNHX25、SpNHX34、SpNHX35、SpNHX37、SpNHX40有10个，SpNHX19、SpNHX20、SpNHX21、SpNHX26含有7个，SpNHX10、SpNHX11含有6个，SpNHX12含有4个，SpNHX16、SpNHX33、SpNHX42只含有3个（图4）。图4海马齿NHX蛋白跨膜结构预测Fig.4TransmembranestructurepredictionsofNHXproteinsinSesuviumportulacastrum第三章海马齿NHX基因在逆境胁迫后的表达分析3.1实验材料3.1.1供试海马齿使用霍格兰营养液（表2）培养对海马齿进行培养，海马齿来自海南省文昌市高隆湾处。选取健康的海马齿作为培养对象，从海马齿的顶端向底端数在第三处的茎节处剪切，取下的长度要大致相同。处理好的海马齿使用可以将植物培养在水体的载体，培养在霍格兰培养液中。海马齿经过一段时间的培养，直到其根的长度达到8cm左右便可以采集使用，叶片采集五片即可。表2Hoagland营养液配置（1倍浓度）化合物分子量贮存液液浓度贮存液液浓度每升最终溶液中贮存液的体积元素元素最终浓度g/molmmol/Lg/Lmlmmol/Lmg/LKNO3101.101000101.106.0N16000224Ca(NO3)2·4H2O236.161000236.164.0K6000235NH4H2PO4115.081000115.082.0Ca4000160MgSO4·7H2O246.481000246.491.0P200062KCL74.55251.8642.0Cl501.77H3BO361.8312.50.77732.0B250.27MnSO4·H2O169.011.00.1692.0Mn2.00.11ZnSO4·H2O287.541.00.2882.0Zn2.00.13CuSO4·5H2O249.680.250.0622.0Cu0.50.03H2MoO4161.970.250.0402.0Mo0.50.05NaFeDTPA(10%Fe)558.56430.00.3-1.0Fe16-531-33.2实验方法3.2.1基于盐胁迫和镉胁迫的转录组数据的基因表达分析 第一组使用霍格兰营养液继续培养7天，第二组在霍格兰营养液中加入40mMNaCl培养7天，第三组在霍格兰营养液中加入40mMNaCl培养14天。镉胁迫采用25mg/LCdCl2溶液，处理海马齿方法和时间同上，将处理好的样本使用干冰保存送往贝瑞和康生物技术公司进行转录组测序分析。进行镉胁迫后海马齿的表达分析需要FPKM值。计算方法如下：FPKM=cDNAFragments/MappedFragments(Millions)×TranscriptLength(kb)片段：与特定转录本比较的片段数量；匹配片段；与转录本匹配的片段数量；转录本长度（kb）：转录本的长度。使用制图软件将热图制作出，根据转录组数据分析，从中选出具有明显变化基因进行实时定量分析。3.2.2实时荧光定量PCR检测对海马齿进行25mg/LCdCl2胁迫处理于0（CK）、2h、4h、6h、8h、12h、7d、12d后取下的根系和叶片并锡纸包裹好，迅速放入液氮中进行急速冷却，分别进行标记然后放入超低温冰箱进行保存，每个处理3次重复。使用天根生化科技公司的RNA提取试剂盒DP441提取RNA，反转录使用GoScriptTMReverseTranscriptionSystem〔普洛麦格（北京）生物技术有限公司，A5001〕合成cDNA第一链。用PrimerPremier5.0设计引物（表3），并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用北京全式金生物技术公司2xTransTaqHighFidelity（HiFi）PCRSuperMix（AS131）进行PCR扩增，PCR需要cDNA模板、上下游引物、2×SYBRqPCRMix和双蒸水配置为10ul的反应体系。PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃15s，58℃30s，72℃60s，40个循环；65℃5s；95℃变性DNA产物。每个基因进行3次重复实验，通过熔融曲线检测扩增产物的纯度。以GAPDH作为内参基因，稳定性好品质优良的内参基因是能够准确分析待测目的基因表达量的关键因素，所以进行实时定量PCR时需要挑选合适的内参基因进行实验，本次实时定量PCR实验选择的管家基因是GAPDH，周琳在2020年发现GAPDH基因能够稳定表达在西红花的六种不同组织间。REF_Ref1538\r\h[19]2020年刘小飞发现GAPDH基因在杜鹃红山茶各器官和各时期稳定性最佳。REF_Ref1649\r\h[20]基因的相对表达量采用Livak法计算，将在对照组的表达量定为1，其他基因及不同处理时间的表达量均与其比较进行定量。表3用于实时定量PCR的引物引物名称引物序列（5-3）碱基数（bp）NHX7-FTGCAGGTCCTCCATCAGG18NHX7-RCATCGAACTAAGGTTGGTCATA22NHX30-FGACGGGATCAGTGACGAA18NHX30-RTGCCCTCAAACCTGCTAT18NHX31-FAGGGGCTTTGAAGGACAA18NHX31-RCCACCCAAGTGTATGACTAACT22NHX32-FGGGAACAGTGAGGACAGAAA20NHX32-RGAAGAATCGGACCTTGGAG19GAPDH-FTTGGCATCGTTGAGGGTCT19GAPDH-RCAGTGGGAACACGGAAAGC193.3结果与分析3.3.1盐胁迫下转录组数据的海马齿NHX家族基因表达分析已经有前人将盐胁迫后海马齿的转录组数据制作成热图（图5）和对其实时荧光定量PCR的数据进行分析，研究盐胁迫后的表达规律。SpNHX的大多数成员在盐胁迫后表达量总体呈现上调趋势。图5盐胁迫下转录组数据的海马齿NHX家族基因表达分析Fig.5GeneexpressionanalysisofSesuviumportulacastrumNHXfamilyintranscriptomicdataundersaltstress3.3.2镉胁迫下转录组数据的海马齿NHX家族基因表达分析利用FPKM值制作的热图（图6），对其NHX基因的转录水平进行分析。结果发现，镉胁迫下，海马齿NHX家族基因均受到不同程度的诱导。根据转录组数据分析，本实验从中选出NHX7、NHX30、NHX31、NHX32具有明显变化的四个基因进行实时定量分析。Ck-14d-RCd-7d-RCk-7d-RCd-14d-APCd-7d-APCk-7d-APAP：叶片Ck-14d-RCd-7d-RCk-7d-RCd-14d-APCd-7d-APCk-7d-APAP：叶片R：根图6镉盐胁迫下转录组数据的海马齿NHX家族基因表达分析Fig.6AnalysisofNHXfamilygeneexpressioninSesuviumportulacastrumfromtranscriptomicdataundercadmiumstress3.3.3镉胁迫下海马齿NHX家族的表达验证由图7可以看出（图7中的A为根部，L为叶片），在镉胁迫下四个SpNHX基因在根和叶的表达量各有不同，随着镉胁迫时间的延长，除了海马齿NHX30在根部的表达量在总体表现上有微小上调趋势外，其余海马齿NHX30在叶片、NHX7在根部和叶、NHX31在根部和叶、NHX32在根部和叶基因的表达量总体都表达出下调趋势。NHX31在根部和叶、NHX7在根部和叶处理过程中的任何时段的表达量都小于0h（空白组）。NHX32在的叶处理过程中的任何时段的表达量都小于0h，NHX32在的根在10h高于0h但是12h又降低于0h。NHX30在根部表达量在10h的表达量高于0h，在6h与0h表达量接近其余时段小于0h，NHX30在叶表达量只有在6h大于0h其余时间段均小于。从总体表达量的数值看其上调和下调的幅度在相对稳定的区间，但是上调的数值稍微高于下调的数值。AerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialPartsAerialParts图7海马齿根系中NHX基因对25mg/LCdCl2胁迫的响应Fig.7ResponseofNHXgenesintherootsandleavesofSesuviumportulacastrumto25mg/LCdCl2stress第四章结论Na+/H+逆向转运蛋白NHX是植物体内一类重要的反向跨膜转运蛋白，其主要作用是将Na+或K+或H+进行跨膜反向转运，维持细胞内pH和Na+的动态平衡，在植物响应盐胁迫、细胞生长发育、离子稳态、渗透调节等生理生化过程中发挥着关键作用。如今已经有许多学者发表文章证明，植物在面对来自环境中的危害胁迫（如高温、干旱、土地盐碱化和土地重金属污染等），植物中的胁迫蛋白相关基因表达会有利于植物抵御有害于其生存的危害胁迫。本实验采用盐生植物海马齿作为研究对象，用重金属镉对其进行胁迫探究NHX基因家族的功能。本实验鉴定了海马齿NHX基因家族的成员共42个，并对42个NHX基因家族成员进行了理化性质的鉴定和分析。选取四个NHX家族成员NHX7、NHX30、NHX31、NHX32，使用这四个成员进行相对表达量分析。通过分析镉胁迫处理时间延长的表达量得知，NHX基因家族对于镉胁迫并不敏感，而且大多数成员在镉胁迫中没有表现出显著的表达升高，但这些基因家族的某些成员如NHX30在使用25mg/LCdCl2处理6h时的叶片当中表现出显著的表达升高。可以克隆该基因家族的特定成员并确认其功能特征。这将允许将这些成员转移到其他植物中进行耐受性研究。本研究结果为海马齿NHX家族基因的克隆及功能预测提供了一定的理论参考。参考文献环境保护部和国土资源部发布全国土壤污染状况调查公报[J].资源与人居环境,2014,(04):26-27.彭少邦,蔡乐,李泗清.土壤镉污染修复方法及生物修复研究进展[J].环境与发展,2014,26(03):86-90.綦峥,齐越,杨红,等.土壤重金属镉污染现状、危害及治理措施[J].食品安全质量检测学报,2020,11(07):2286-2294.DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2020.07.048.吴双桃.镉污染土壤治理的研究进展[J].广东化工,2005,(04):40-41+50.中国植物志.北京市，中国科学院植物研究所,2007-01-01.杨成龙.海马齿甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及功能验证[D].海南大学,2014.张利红,李培军,李雪梅,等.镉胁迫对小麦幼苗生长及生理特性的影响[J].生态学杂志,2005,(04):458-460.MunnsR.Comparativephysiologyofsaltandwaterstress.PlantCellEnviron.2002Feb;25(2):239-250.doi:10.1046/j.0016-8025.2001.00808.x.PMID:11841667.ZörbC,NollA,KarlS,LeibK,YanF,SchubertS.MolecularcharacterizationofNa+/H+antiporters(ZmNHX)ofmaize(ZeamaysL.)andtheirexpressionundersaltstress.JPlantPhysiol.2005Jan;162(1):55-66.doi:10.1016/j.jplph.2004.03.010.PMID:15700421.SzeH,ChanrojS.PlantEndomembraneDynamics:StudiesofK+/H+

AntiportersProvideInsightsontheEffectsofpHandIonHomeostasis.PlantPhysiol.2018Jul;177(3):875-895.doi:10.1104/pp.18.00142.Epub2018Apr24.PMID:29691301;PMCID:PMC6053008.BrettCL,DonowitzM,RaoR.E