肺泡灌洗液二代测序在重症肺炎患者中的应用

肺泡灌洗液二代测序在重症肺炎患者中的应用摘要：目的探讨肺泡灌洗液二代测序在重症肺炎患者中的应用效果。方法选取2022年1月至2022年6月在我院急诊科收治的30例重症肺炎并行肺泡灌洗液二代测序的患者为研究对象，按照检测方法分常规组和观察组，各15例。常规组患者进行普通微生物培养，观察组在对照组的基础上采用肺泡灌洗液mNGS检测。比较两组患者检测的病原菌的数量和分布情况、灵敏度、特异度及准确率。结果：常规组G－菌(17株)

、G＋菌(11株)、病毒(9株)、真菌(2株)、检出均低于观察组G－菌(33株)、G＋菌(25株)、病毒(17株)、真菌(3株)；常规组患者检测的灵敏度为（83.67%）、特异度为（53.33%）、准确率（60.00%），低于观察组患者检测的灵敏度为（100.00%）、特异度为（100.00%）、准确率（93.33%），两组检测方法相比，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：对重症肺炎患者采用肺泡灌洗液mNGS检测其病原菌的灵敏度及特异度更高。

关键词：肺泡灌洗液二代测序；重症肺炎；病原菌；应用效果肺炎(pneumonia)具备下述前4项中任何1项加上第5项，并除外肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺问质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸性粒细胞浸润症、肺血管炎等即可诊断。包括：①新近出现的咳嗽、咯痰或原有呼吸道症状加重，出现脓性痰，伴或不伴胸痛；②发热；③肺实变体征和(或)湿性哕音；④外周血白细胞计数(WBC)>10×109／L或<4×109／L，伴或不伴核左移；⑤胸部影像学检查显示新出现片状、斑片状浸润性阴影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液[1]。社区获得性肺炎(community-acquiredpneumonia,CAP)是指在医院外罹患的感染性肺实质(含肺泡壁,即广义上的肺间质)炎症,包括具有明确潜伏期的病原体感染而在入院后潜伏期内发病的肺炎[2]。其重症者称为重症社区获得性肺炎(severecommunity-acquiredpneumonia，SCAP）。医院获得性肺炎（hospital-acquiredpneumonia，HAP）是指患者入院时不存在，也不处于感染潜伏期内，而于人院48h后在医院发生的肺炎，其重症者称为重症医院获得性肺炎(severehospital—acquiredpneumonia，SHAP)。肺部感染病原菌的分布以及耐药情况有了很大的变迁，为及时了解患者肺部感染病原菌的变迁及耐药情况[3]。随着医学的不断发展宏基因组二代基因测序（MetagenomicNext-generationSequencing，mNGS）技术的也在不断提高，目前，mNGS在临床检测当中，已成为最常见且有效的检测手段。本次研究旨在探讨肺泡灌洗液二代测序在重症肺炎病原菌患者中的应用效果。现报道如下。1一般资料与方法1.1一般资料选取在我院急诊科收治的30例重症肺炎为研究对象，按照检测方法分常规组和观察组，各15例。其中常规组中9例女性，6例男性，年龄在48岁至73岁，平均（60.68±1.43）岁，初中及以下7例，高中5例，高中以上3例；观察组8例女性，7例男性，年龄在39岁至74岁，平均（61.29±1.26）岁，初中及以下5例，高中6例，高中以上4例。纳入标准：（1）患者符合重症肺炎诊断标准；（2）患者临床资料完整：（3）患者无其他慢性疾病。排除标准：（1）患者对药物过敏；（2）患者存在精神障碍；（3）患者依从性不高。两组在一般资料当中，无统计学意义（P>0.05）。1.2方法常规组支气管肺泡灌洗和BALF收集重症MPP是支气管肺泡灌洗的适应证。支气管镜检查由经验丰富的医师操作。在咪达唑仑静脉镇静下，经鼻进镜，使用2%的利多卡因气道黏膜表面麻醉。到达病变部位时，将支气管镜末端楔入病变段或肺叶，经气管镜工作通道注入温热生理盐水进行灌洗，每次20-50ml，总量60-120ml，灌洗后立刻抽吸，抽吸压力为100mmHg，将回吸收的BALF吸收至痰液收集器中。留取收集到的BALF5-10mL置于冰箱4℃保存，24h内送检微岩医学进行mNGS病原检测。剩余BALF常规送检验科进行呼吸道病原抗原9项检测（呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1-3型、流感病毒A、B型、偏肺病毒、鼻病毒、沙眼衣原体DNA和肺炎支原体DNA）、BALF培养、真菌GM试验及抗酸染色涂片。观察组采用肺泡灌洗液mNGS检测，即：（1）样本护理和DNA提取：取0.5～3ml痰夜，经玻璃珠混合震荡后依据TIANampMicroDNAKit试剂盒步骤提取DNA。（2）文库构建和测序：应用Agilent2100Bioanalyzer质控文库片段大小，应用QubitdsDNAHSAssayKit质控分析DNA文库浓度，环化形成单链环形结构。文库环化后经滚环复制生成DNB纳米球，将其加载到测序芯片，通过BGISEQ-500测序。（3）数据分析：将长度小于35bp和低质量数据去除，通过BWA对比，去除高质量数据中比对上人参考基因序列，剩下数据将低复杂度reads去除后，和专用微生物大数据比对，按照细菌、病毒、真菌、寄生虫将比对后数据进行分类和排列。依据检出毒力基因、耐药基因的信息应用抗菌药物治疗。1.3观察指标和评价观察分析两组患者痰液、血液、BALF标本中病原菌的数量和分布情况（G－菌、G＋菌、病毒、真菌）、灵敏度、特异度及准确率。1.4统计学处理对数据进行处理，采用SPSS16.0统计软件，计数资料采取X2检验，若P＜0.05，则表明差异有显著性，若P＞0.05，则表明差异没有显著性。2结果2.1病原菌的数量和分布情况常规组G－菌(17株)、G＋菌(11株)、病毒(9株)、真菌(2株)、检出均低于观察组G－菌(33株)、G＋菌(25株)、病毒(17株)、真菌(3株)；详情见表1。表1两组病原菌的数量和分布情况常规组观察组病原体株数总构成比（%）病原体株数总构成比（%）G－菌(17株)G－菌(33株)铜绿假单孢菌529.41铜绿假单孢菌824.24流感嗜血杆菌317.65流感嗜血杆菌618.18大肠埃希菌211.76大肠埃希菌515.15嗜肺军团菌423.53嗜肺军团菌721.21肺炎克雷伯菌317.65肺炎克雷伯菌721.21G＋菌(11株)G＋菌(25株)肠球菌属436.36肠球菌属728.0金黄色葡萄球菌327.27金黄色葡萄球菌832.0肺炎链球菌436.36肺炎链球菌1040.0病毒(9株)病毒(17株)腺病毒444.44腺病毒758.82甲型流感333.33甲型流感635.29乙型流感222.22乙型流感423.53真菌(2株)真菌(3株)黄曲霉150.0黄曲霉266.67青霉菌150.0青霉菌133.332.2两组灵敏度、特异度及准确率比较常规组患者灵敏度为、特异度为及准确率，均低于观察组患者，两组检测方法相比，差异有统计学意义（P<0.05），详情见表2。表2两组两组灵敏度、特异度及准确率比较组别灵敏度特异度准确率常规组（n=15）83.6753.3360.00观察组（n=15）100.00100.0093.33X27.31810.60411.888P<0.05<0.05<0.053讨论重症肺炎具有病情进展快、死亡率高的特点，患者伴有呼吸衰竭症状，严重情况下，可出现昏迷、意识障碍等症状，从而诱发脑疝，可能因中枢性呼吸衰竭导致死亡[4]。该病还可累及循环系统，具体症状为心率加快、肺部啰音增加、脉搏微弱等，当发生休克时，面色苍白，血压降低[5]。尽早明确其病原体类型至关重要，能为疾病干预提供依据，选择针对性药物予以治疗。然而，重症肺炎因病情进展迅速，既往采用传统方法行常规病原体检测，由于受到条件限制，可能无法完全反映细菌丰富度与类别，高通量测序的效果则更显著[6]。随着医学技术发展，mNGS技术在病原菌检测中被应用，体现出较多优势。该技术无需行微生物培养，可直接对相关基因组遗传物质进行提取，从而分析微生物群体，对菌群的检测更加真实、可靠[7]。随着抗生素的广泛使用，细菌的病原分布有了较大的变迁，感染菌的复杂性和耐药性给临床治疗带来许多困难。本研究常规组G－菌(17株)

、G＋菌(11株)、病毒(9株)、真菌(2株)、检出均低于观察组G－菌(33株)、G＋菌(25株)、病毒(17株)、真菌(3株)。分析认为可能与大部分病例在入院前使用过抗生素，导致L型细菌的产生影响检出率以及某些菌种对培养环境的要求较高导致漏检有关。另外，从细菌耐药性方面分析看出，革兰氏阴性菌在肺炎的细菌病原分布中占主要部分，对常用抗生素的敏感性在逐步降低，耐药菌株在逐步增加。因此，作者认为，呼吸道感染患者应尽快进行痰培养及药物敏感试验，根据药敏试验结果给临床提供参考，帮助其合理选择抗生素，杜绝乱用、滥用抗生素，减轻患者的负担。本研究显示，观察组检测准确率（93.33%）高于常规组（60.00%），提示mNGS检测效果更理想。mNGS检测被证实可对DNA病毒、细菌同时予以检测，而传统检测方法则无法满足该需求[8]。在本研究中，mNGS检测采用了高通量测序技术，且直接对样品总DNA进行提取，可使细胞彻底裂解，即便细胞附着于颗粒上，也能取得较可靠破碎效果。研究认为，在mNGS检测中利用直接提取原理对DNA进行提取，可减少DNA流失，从而使微生物结构更加完整。因此，采用这种方式，能取得更好的检测效果。综上所述，重症肺炎患者采用肺泡灌洗液mNGS检测其病原菌中具有较高的应用价值，检测的灵敏度及特异度较高，其准确率也高，总体检出效果较理想，且可为临床治疗提供依据。参考文献：[1]中国急诊重症肺炎临床实践专家共识[J].中国急救医学.2016,36(2):91-107.[2]徐玉惠.宏基因组二代测序技术在重症肺炎病原学检测中的价值[D].吉林大学,2021.[3]陈友莲,刘雪燕,陈怀生,等.肺泡灌洗液宏基因组二代测序技术在重症肺炎患者中的临床价值[J].现代医药卫生,2022,38(01):31-34.[4]戴媛媛,马筱玲.宏基因组二代测序技术在临床病原学诊断中的应用[J].临床检验杂志,2021,39(01):1-5.[5]孙国先,刘微丽,郑庆斌,等.肺泡灌洗液二代测序在重症肺炎病原菌未明患者中的应用[J].中国