生物化学实验指导实验一蛋白质的性质实验（一）（呈色反应）一、目的1

生物化学实验指导实验一蛋白质的性质实验（一）（呈色反应）一、目的1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、虽色反应：(一)双缩脱反应：1.原理：尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。2.试剂：(1)尿索：10克(2)10%氢氧化钠溶液250毫升(3)1%硫酸铜溶液60毫升(4)2％卵清蛋白溶液80毫升3.操作方法：取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。(二)茚三酮反应1.原理：除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。反应机理如下：此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。2.试剂：(1)蛋白质溶液100毫升2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9)(2)0.5％甘氨酸溶液80毫升(3)0.1％茚三酮水溶液50毫升(4)0.1％茚三酮—乙醇溶液20毫升3.操作方法：(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。(2)在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。(三)黄色反应：1.原理：含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反应式如下：多数蛋白质分子台有带苯坏的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。2.试剂：(1)鸡蛋清溶液100毫升将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。(2)大豆提取液100毫升将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。(3)头发(4)指甲(5)0.5％苯酚溶液50毫升(6)浓硝酸200毫升(7)0.3％色氨酸溶液10毫升(8)0.3％酪氨酸溶液10毫升(9)10％氢氧化钠溶液100毫升3.操作方法：向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10％氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。(四)乙醛酸反应1.原理：在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质,反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。含有色氨酸的蛋白质也有此反应。2.试剂：(1)蛋白质溶液100毫升鸡蛋清：水＝1：20(2)0.03％色氨酸溶液10毫升(3)冰醋酸200毫升(4)浓硫酸(分析纯)100毫升3.操作方法：取3支试管。编号。分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2毫升。混匀后倾斜试试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约I毫升，静置。观察各管液面间紫色环的出现。若不明显，可于水浴中微热实验二蛋白质的性质实验（二）（沉淀反应）一、蛋白质等电点的测定：1.目的：(1)了解蛋白质的两性解离性质。(2)学习测定蛋白质等电点的一种方法2.原理：蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。3.器材：(1)水浴锅。(2)温度计。(3)200毫升锥形瓶。(4)100毫升容量瓶。(5)吸管。(6)试管。(7)试管架。(8)乳钵。4.试剂：(1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200毫升取0.4克酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研6，将所得的蛋白质悬波移入200毫升锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10毫升1当量/升醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100毫升容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。(2)1.00当量／升醋酸溶液100毫升(3)0.10当量／升醋酸溶液100毫升(4)0.01当量／升醋酸溶液50毫升5.操作方法：(1)取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。二、蛋白厦的沉淀及变性：1.目的：(1)加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。(2)了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。(3)了解蛋白质变性与沉淀的关系。2.原理：在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。(1)可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。(2)不可逆沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金届离子或某些有机酸的反应都属于此类。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因此变性蛋白质并不一定部表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。3.试刘与材料：(1)蛋白质溶液500毫升5％卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液(新鲜鸡蛋清：水＝1：9)(2)pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100毫升(3)3%硝酸银溶液10毫升(4)5％三氯乙酸溶液50毫升(5)95％乙醇250毫升(6)饱和硫酸铵溶液250毫升(7)硫酸铵结晶粉末1000克(8)0.1当量／升盐酸溶液300毫升(9)0.1当星／升氢氧化钠溶液100毫升(10)0.1当员／升碳酸钠溶液100毫升(11)0.1当量／升醋酸溶液100毫升(12)甲基红溶液20毫升(13)2％氯化钡溶液150毫升4.操作方法：(1)蛋白质的盐析。无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。加5％卵靖蛋白溶液5毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，l此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。(2)重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加3％硝酸银溶液1～2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾出上消液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？(3)某些有机酸沉淀蛋白质取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入1毫升5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。(4)有机溶剂沉淀蛋白质取一支试管，加入2毫升蛋白质溶液，再加入2毫升95％乙醇。混匀，观察沉淀的生成。(5)乙醇引起的变性与沉淀取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8毫升，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红．再分别用0.1当量／升醋酸溶液及0.1当星／升碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1当量／升盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。实验二蛋白质的两性反应及等电点的测定蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点(pI)。当+液的pH值低于蛋白质等电点时，即在H较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为—离子，当溶液的pH值大于等电点时，即在OH较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成阴离子。本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。(三)蛋白质的沉淀反应蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的、相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。该反应可分为以下两种类型:1.可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质。沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。这种沉淀反应称为可逆沉淀反应。属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白质的短时间作用以及等电点沉淀等。用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。沉淀出的蛋白质仍保持其天4然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度、种类不同，所以在不同条件下，采用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，这种方法称为蛋白质的分级盐析。它在酶的生产和制备等工作中被广泛应用。2.不可逆的沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白质的性质，这时蛋白质已发生变性。变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超生波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的2+2+2+2+3+金属离子，如Zn、Cu、Hg、Pb、Fe结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐存在，当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解在水中，说明它已发生了变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质;临床上则用蛋白质解除重金属盐食物性中毒。但应注意，过量的醋酸铅或硫酸铜可使沉淀的蛋白质再溶解。蛋白质在有机酸的作用下带正电荷，与酸根的负电荷结合成为溶解度很小的盐类而沉淀。三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，可将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛应用。【实验试剂和器材】（一）试剂1.卵清蛋白溶液：取5ml鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—层纱布过滤,新鲜配制。2.0.5%酪蛋白(以0.01NNaOH作溶剂)3.酪蛋白-醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水20ml及1.00NNaOH溶液5ml(必须准确)。摇荡使酪蛋白溶解。然后加1.00N醋酸5ml((必须准确)，倒入50ml蒸馏瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10N醋酸钠溶液内，酪蛋白的浓度为0.5%。4.蛋白质-NaCl溶液:取20ml蛋清,加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。5.0.5%甘氨酸，0.3%酪氨酸，0.5%色氨酸6.尿素，双缩脲试剂，0.1%茚三酮乙醇溶液，浓硝酸，10%NaOH7.0.01%溴甲酚绿指示剂，0.02NHCl，0.02NNaOH，0.01NHAc，0.10NHAc，1.00NHAc8.饱和硫酸铵溶液,硫酸铵粉末,2%硝酸银,0.1%硫酸铜,饱和硫酸铜,10%三氯乙酸,（二）器材试管及试管架，酒精灯，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管，恒温水浴。【实验方法】1.双缩脲反应取少量尿素结晶，加入干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后加入10滴双缩脲试剂，混匀,观察颜色变化。另取1支试管，加入卵清蛋白溶液1ml再加入5滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色变化。2.茚三酮反应取2支试管，分别加入卵清蛋白溶液和0.5%甘氨酸溶液4滴，再加入2滴0.1%茚三酮乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸呈色深浅。3.黄色反应按下表分别向6支试管中加入试剂，微火小心加热(不必沸腾)，观察颜色变化。再滴加10%NaOH溶液使呈碱性，观察颜色变化。管号123456卵清蛋白0.3%酪氨酸0.3%色氨酸5%苯酚指甲头发样品(滴)4444少许少许浓硝酸(滴)222220204.蛋白质的两性反应（1）取1支试管，加入1ml0.5%酪蛋白和5-7滴0.01%溴甲酚绿指示剂（变色范围是pH3.8—5.4，在酸性溶液中为黄色，在碱性溶液中为蓝色），混匀，观察溶液的颜色。（2）用滴管缓慢加入0.02NHCl溶液，随加随摇，直到有大量沉淀产生。说明原因，并观察溶液颜色的变化。（3）继续滴入0.02NHCl溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，说明原因。（4）再缓慢滴入0.02NNaOH溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化过程，说明原因。5.酪蛋白等电点的测定取9试管编号后按下表顺序准确加入试剂。加入每种试剂后应混匀。（单位：ml）123456789123456789管号试剂蒸馏水2.43.2—2.03.03.51.52.753.381.00NHAc1.60.8———————0.10NHAc——4.02.01.00.5———0.01NHAc——————2.51.250.62酪蛋白-NaAc1.01.01.01.01.01.01.01.01.0溶液的最终pH3.53.84.14.44.75.05.35.65.9沉淀出现的情况静置约20分钟,观察每支试管内的混浊度,以-,+,++,+++,++++符号表示沉淀的多少。根据观察结果，指出哪个pH是酪蛋白的pI。6.蛋白质的盐析作用(选做)取1支试管，加入3ml蛋白质-NaCl溶液和3ml饱和硫酸铵溶液，混匀，静置0分钟，球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，至粉末不再溶解，析出的沉淀为清蛋白。静置，弃上部清液，取部分清蛋白沉淀加水稀释，观察它是否溶解。7.重金属沉淀蛋白质(选做)取2支试管，各加入约1ml卵清蛋白质液，分别加入2%硝酸银溶液及0.1%硫酸铜溶液1滴，观察沉淀的生成。对第2支试管再加入过量的饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。8.有机酸沉淀蛋白质(选做)取1支试管，加入卵清蛋白质液约0.5ml，然后滴加10%三氯乙酸溶液数滴，观察沉淀的生成。【思考题】1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此作何结论?2.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?若不是，为什么?3.在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低?4.蛋白质分子中的哪些基团可以与(1)重金属离子作用而使蛋白质沉淀?(2)有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀?实验三糖类的性质实验（一）(糖的颜色反应)一．目的要求1、了解糖类某些颜色反应的原理。２、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。二.原理

糖经浓无机酸处理，脱水产生糠醛或糠醛衍生物。戊糖形成糠醛，己糖则形成羟甲基糠醛。这些糠醛和糠醛衍生物在浓无机酸作用下，能与酚类化合物缩合生成有色物质。与一元酚如α－萘酚作用，形成三芳香环甲基有色物质。与多元酚如间苯二酚作用，则形成氧杂蒽有色物质，反应式如下：

通常使用的无机酸为硫酸。如用盐酸，则必须加热。常用的酚类为α－萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等，有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等。有人认为，用浓硫酸作为脱水剂时，形成有颜色的产物与酚核的磺化有关，见如下反应式：一、糖的呈色反应1．Molish反应（α－萘酚反应）本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应。糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与α－萘酚作用，形成红紫色复合物。在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。２器材（１）试管及试管架（２）滴管３试剂（１）莫氏试剂５％a-奈酚的酒精溶液１５００毫升（２）１％葡萄糖溶液１００毫升（３）１％果糖溶液１００毫升（４）１％蔗糖溶液１００毫升（５）１％淀粉溶液１００毫升（６）０．１％糠醛溶液１００毫升（７）浓硫酸５００毫升４、取五支试管，分别加入１％葡萄糖溶液、１％果糖溶液、１％蔗糖溶液、１％淀粉溶液、０．１％糠醛溶液各一毫升。再向五支试管中个加入２滴莫氏试剂，充分混合。斜执试管，沿管壁慢慢加入浓硫酸约１毫升，慢慢立起试管，切勿摇动。浓硫酸在试液下形成两层。在二液分解出有紫红色环出现。观察、记录各管的颜色。２．Seliwanoff反应（间苯二酚反应）该反应是鉴定酮糖的特殊反应。在酸作用下，己酮糖脱水生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物，反应迅速，仅需20—30s。在同样条件下，醛糖形成羟甲基糠醛较馒。只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸，才给出微弱的阳性反应。蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应。２、器材（１）试管及试管架（２）滴管（３）水浴锅３、试剂（１）塞氏试剂１０００毫升（２）１％葡萄糖溶液１００毫升（３）１％果糖溶液１００毫升（４）１％蔗糖溶液１００毫升４、操作取三支试管，分别加入１％葡萄糖溶液、１％果糖溶液、１％蔗糖溶液各０．５毫升。再向各管分别加入塞氏试剂５毫升，混匀。将三支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜色的变化及变化时间。思考题可用何种反应鉴别酮糖的存在？２、a-奈酚反应的原理？实验总结（一）a-奈酚反应试剂现象解释现象１％葡萄糖溶液１％果糖溶液１％蔗糖溶液１％淀粉溶液０、１％糠醛溶液（二）间苯二酚反应试剂现象解释现象１％葡萄糖溶液１％果糖溶液１％蔗糖溶液实验四糖类的性质实验（二）(糖类的还原作用)目的学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。二、原理含有自由醛基或酮基的单糖和二糖为还原糖。在碱性溶液中，还原糖能将金属离子（铜、铋、汞、银等）还原，糖本身被氧化成酸类化合物，此性质常用于检验糖的还原性，并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据。1．Fehling反应费林试剂是含有硫酸铜与酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。上述反应可用下列方程式表示：在碱性条件下，糖不仅发生烯醇化、异构化等作用。也能发生糖分子的分解、氧化、还原或多聚作用等。由这些作用所形成的复杂混合物具有强烈的还原作用，因此企图用简单的氧化还原作用来写出反应平衡式是不可能的。为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应．2．Benedict反应Benedict试剂是Fehling试剂的改良。它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性比Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点。3．Barfoed反应该反应的特点是在酸性条件下进行还原作用。在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。单糖在3min内就能还原Cu2+而还原二糖则需20min。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖被水解也能呈现阳性反应，如蔗糖在10min内水解而发生反应。还原二糖浓度过高时，也会很快呈现阳性反应，若样品中含有少量氯化钠也会干扰此反应。三.试剂和器材1、测试糖液１％葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、1％淀粉溶液各１００毫升。

2、试剂斐林（Fehling）试剂，苯尼迪克特（Benedict）试剂个１０００毫升。

3、器材试管，试管架，电炉和沸水浴等。四.操作方法先取一支试管加入斐林试剂约１毫升，在加入４毫升蒸馏水，加热煮沸，如有沉淀生成，说明此试剂已不能用。经检验试剂合格后，在进行下述试验。取五支试管，分别加入２毫升的斐林试剂，在向各试管分别加入１％葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、1％淀粉溶液各１毫升。置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却。观察各管溶液的变化。另取六支试管，用苯尼迪克特试剂重复上述试验。比较两种试法的结果。五、思考题１、斐林试剂、苯尼迪克特试剂试法检验糖的原理是什么？２、试比较斐林试剂、苯尼迪克特试剂试法？实验总结斐林试剂、苯尼迪克特试剂法溶液现象试剂１％葡萄糖、１％果糖１％麦芽糖、１％蔗糖1％淀粉溶液斐林试剂苯尼迪克特试剂六.注意事项（l）Molish反应非常灵敏，0.001％葡萄糖和0.0001％蔗糖即能呈现阳性反应。因此，不可使碎纸屑或滤纸毛混入样品中。过浓的果糖溶液，由于硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色。需稀释糖溶液后重做．（2）果糖在Seliwanoff试剂中反应十分迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间长，且只能产生黄色至淡红色。戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合，生成绿色到蓝色产物。（3）酮基本身并没有还原性，只有在变为烯醇式后，才显示还原作用．（4）糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。有保护胶体存在时，常生成黄色沉淀。实际生成的沉淀含有大小不同的Cu2O颗粒，因而每次观察到颜色可能略有不同。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来区别。（5）Barfoed反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。应注意观察试管底部红色的出现，它与一般还原性实验不相同，观察不到反应液由蓝色变绿变黄或变红的过程。实验五酶的特性一、目的：加深对酶的性质的认识。二、内容：·本实验由温度对酶的活力的影响；pH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专一性四组实验组成。(一)温度对酶活力的影响1．原理：酶的催化作用受温度的影响，在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37～40℃，植物酶的最适温度为50～60℃。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显改变，但在I100℃的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。2．器材：(1)试管及试管架，(2)恒温水浴。(3)冰浴。(4)沸水浴。3．试剂和材料：(1)0.2％淀粉的0.3％氮化钠溶液150毫升需新鲜配制。(2)稀择50倍的唾液50毫升用蒸馏水漱口，以清除食物残渣、再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量简并稀碌50倍，(稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整)混匀备用。(3)碘比钾—碘溶液50毫升将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中。使用前稀释10倍。4．操作方法：淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，退碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遏碘不呈颜色，麦芽糖遏碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。取3支试管，编号后按下表加入试剂：摇匀后，将1号、3号两试管放人37℃恒温水浴中，2号试管放人冰水中。10分钟后取出，(将2号管内液体分为两半)用碘化钾—碘溶液来检验1、2、3管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将二号管剩下的一半镕液放人37℃水浴中继续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何？(二)pH对酶活性的影响1．原理：酶的活力受环境pH的影响极为显著；不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6．8。2．器材：(1)试管及试管架。(2)吸管。(3)滴管。(4)50毫升锥形瓶。(5)恒温水浴。3．试剂和材料：(1)新配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液250毫升(2)稀释50倍的新鲜唾液100毫升·(3)0.2摩尔／升磷酸氢二钠溶液600毫升(4)0.1摩尔柠檬酸溶液400毫升(5)碘化钾—碘溶液50毫升(6)pH试纸：pH＝5、pH＝5．8、pH＝6．8、PH＝8四种4．操作方法：取4个标有号码的50毫升锥形瓶。用吸管按下表添加0.2摩尔／升磷酸氢二钠溶液和0.1摩尔／升柠檬酸溶液以制备pH5．0一8．0的四种缓冲液。从四个锥形瓶中各取缓冲液3毫升，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5％淀粉溶液2毫升和稀释50倍的唾液2毫升。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管内容物混匀，井依次置于37℃恒温水浴中保温。第四管加入唾液2分钟后，每隔I分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液。添加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第一管起，亦均为1分钟。观察各试管内容物呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。(三)唾液淀粉酶的活化和抑制1．原理：酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。2．器材：(1)恒温水浴。(2)试管及试管架。3．试剂和材料：(1)0.1％淀扮溶液150毫升(2)稀释50倍的新鲜唾液150毫升(3)1％氯化钠溶液50毫升(4)1％硫酸铜镕液50毫升(5)1%硫酸钠溶液50毫升(6)碘化钾—碘溶液100毫升4．操作方法：解释结果，说明本实验第3管的意义。(四)酶的专一性1．原理：酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解，蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解，用Benedict试剂检查糖的还原性。2．器材：(1)恒温水浴。(2)沸水浴。(3)试管及试管架．3．试剂和材料：(1)2％蔗糖溶液150毫升(2)溶于0.3%的氯化钠的1％淀粉溶液150毫升(需新鲜配制)(3)稀释50倍的新鲜唾液100毫升(4)蔗糖酶溶液100毫升将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2—3次(离心法)，然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100克，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙用力研磨，提取约1小时，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。(5)Benedict氏试剂200毫升无水硫酸铜1.74克溶于100毫升热水中，冷却后稀释至150毫升。取柠檬酸钠173克，无水碳酸钠100克和600毫升水共热，溶解后冷却并加水至850毫升。再将冷却的150毫升硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。4.操作方法(1)淀粉酶的专一性：解释实验结果(提示：唾液除含淀粉酶外近合有少旦麦芽糖酶)。(2)蔗糖酶的专一性：解释实验结果。三、注意事项

（1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验2、3、4应随时检查反应进行情况。如反应进行得太快，应适当稀释唾液；反之，则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。（2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量Cl－。另外，注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。四、思考题：

１．何谓酶的最适pH和最适温度？

２．说明底物浓度、酶浓度、温度和pH对酶反应速度的影响。３．酶作为一种生物催化剂，有哪些催化特点？４．为什么温度会影响酶的活性？５．PH值对酶的活性如何影响？什么是最适PH？与那些因素有关？６．为什么温度对酶的活性具有双重影响？什么是酶的最适温度？它是表征常数吗？与那些因素有关？有何实践意义。实验六甲醛滴定法测定氨基氮一、目的：初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。二、原理：氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：－NH3是弱酸，完全解离时pH为11—12或更高，若用碱滴定一NH3所释放的H＋来测量氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示终点。常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平衡右移，促使－NH3释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内(pH9．0左右)。因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品是多种氨基酸的混合物如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加时，表示水解作用已完全。三、器材：1．25毫升锥形瓶。2．3毫升微量滴定管。3．吸管。四、试剂：1．0．1当量／升标准甘氨酸溶液300毫升准确称取750毫克甘氨酸，溶解后定容至100毫升。2．0．1当量／升标准氢氧化钠溶液500毫升3．酚酞指示刘20毫升0.5％酚酞的50％乙酵溶液4．中性甲醛溶液400毫升在50毫升36—37％分析纯甲醛溶液中加入1毫升0.1％酚酞乙醇水溶液，用0.1当量／升的氢氧化钠镕液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中，此试剂在临用前配制。如已放置一段时间，则使用前需重新中和。五、操作方法：锥形瓶编号试剂样品1样品2空白1%甘氨酸溶液或样品（ml）2.02.0—蒸馏水（ml）5.05.07.0中性甲醛溶液（ml）5.05.05.00.05%溴麝香草酚蓝溶液（滴）2220.5%酚酞乙醇溶液（滴）4441．取3个25毫升的锥形瓶，编号。向第1、2号瓶内各加入0.1当量／升的标准甘氨酸溶液2毫升和水5毫升，混匀。向3号瓶内加入7毫升水。然后向三个瓶中各加入5滴酚酞指示剂，混匀后各加2毫升甲醛溶液再混匀，分别用0.1当量／升标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的毫升数。取平均值，计算甘氨酸氨基氮的回收率。公式中实际测得量为滴定第1和2号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数的平均值与第3号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液毫升数之差乘以标准氢氧化钠的当量浓度，再乘以14．008。2毫升乘以标准甘氨酸的当量浓度再乘14．008、即为加入理论量的毫克数。2．取未知浓度的甘氨酸溶液2毫升，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。计算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克数。公式中V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。V对为滴定对照液(3号瓶)耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NNaOH为标推氢氧化钠溶液的真实当量浓度。五、注意事项利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。六、实验报告根据滴定结果，总结分析此法在实际应用中的优缺点。，七、思考题1、甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么/2、为什么氢氧化钠溶液滴定氨基酸的—N+H3基上的H+，不能用一般的酸碱指示剂？实验七脂肪酸的β-氧化一、目的：了解脂肪酸的β—氧化作用。二、原理：在肝脏中，脂肪酸经β—氧化作用生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成真β—羟丁酸。乙酰乙酸、β—羟丁酸和丙酮总称为酮体。本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。反应式如下：剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠溶液滴定。根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫化硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。三、器材：1．5毫升微量滴定管。2．恒温水浴。3．吸管。4．剪刀及镊子。5．50毫升锥形瓶。6．漏斗。7．试管及试管架。四、试剂和材料：1．家兔2．0.1％淀粉溶液20毫升3．0．9％氯化钠溶液200毫升4．0．5当量／升丁酸溶液150毫升取5毫升丁酸溶于100毫升0．5当量／升氢氧化钠溶液中。5．15％三氯乙酸溶液200毫升6．10％氢氧比钠溶液150毫升7．10％盐酸解液150毫升8．0.1当量／升碘溶液200毫升称取12．7克碘和约25克碘化钾溶于水中，稀释到1000毫升，混匀，用标准o．1当量／升硫代硫酸钠溶液标定。9．标推0．02当昼／升硫代硫酸钠溶液500毫引临用时将已标定的1当量／升硫代硫酸钠溶液稀释成0．02当量／升。10．1／15摩尔／升pH7．6磷酸盐缓冲液200毫升1/15摩尔／升磷酸氢二钠86．8毫升与1/15摩尔／升磷酸二氢钠13．2毫升混合。五、操作方法：1．肝糜制备：将家免颈部放血处死，取出肝脏。用0．9％氯化钠溶液洗去污血。用滤纸吸去表面的水分。称取肝组织5克置研钵中。加少量0．9％氯化钠溶液，研磨成细浆。再加0．9％氯化钠溶液至总体积为10毫升。2．取2个50毫升锥形瓶，各加入3毫升1／15摩尔／升pH7．6的磷酸盐缓冲液。向一个锥形瓶中加入2毫升正丁酸；另一个锥形瓶作为对照，不加正丁酸。然后各加入2毫升肝组织糜。混匀、置于43℃恒温水浴内保温。3．沉淀蛋白质：保温1．5小时后，取出锥形瓶各加入3毫升15％三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加2毫升正丁酸，混匀，静置15分钟后过滤。将滤液分别收集在2支试管中。4．酮体的测定：吸取两种滤液各2毫升分别放入另外两个锥形瓶中，再各加3毫升0．1当量／升碘溶液和3毫升10％氢氧化钠溶液。摇匀后，静登10分钟。加入3毫升10％盐酸溶液中和。然后用0．02当量／升标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘。滴至浅黄色时，加人3滴淀粉溶液作指示剂。摇匀，并继续滴到蓝色消失。记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠溶液的毫升数，并按下式计算样品中丙酮含量。5．计算：肝糜催化生成的丙酮量(毫摩尔／克)＝(A—B)×N×5/6A在上式中为滴定对照所消耗的0．02当里／升硫代硫酸钠溶液的毫升数。B为滴定样品所消耗的0．02当员／升硫代硫酸钠溶液的毫升数。N：为标准硫代硫酸钠溶液浓度(当量／升)。实验八肝糖原的提取与鉴定肝糖原的提取及鉴定一、实验目的

1.了解肝糖原的性质并掌握其提取方法。

2.熟悉肝糖原的鉴定方法。

二、实验原理

糖原属于高分子糖类化合物，是动物体内糖的主要储存形式，在肝脏内储量较为丰富。糖原在体内的合成与分解代谢，对血糖浓度的调节起着重要的作用。

糖原微溶于水，无还原性，与碘作用生成红色。常用的提取肝糖原的方法是将新鲜的肝组织与石英砂共同研磨以破坏肝组织，加入三氯醋酸溶液沉淀其中的蛋白质，离心除去沉淀。上清液中的肝糖原则通过加入乙醇沉淀而得。将沉淀的糖原溶于水，取一部分加入碘观察颜色反应，另一部分经酸水解成葡萄糖后，用斑氏试剂(Benedict)检验。

三、仪器、原料和试剂

仪器

研钵、离心机、离心管、电炉、广泛试纸、滤纸、试管等。

原料

新鲜动物肝脏

试剂

1.10%的三氯醋酸溶液

2.5%的三氯醋酸溶液

3.95%乙醇

4.浓盐酸

5.20%的NaOH溶液

6.碘液：碘1g、碘化钾2g溶于500mL蒸馏水中。

7.斑氏试剂将硫酸铜17.3g溶于100mL温蒸馏水中；将柠檬酸钠173g和无水碳酸钠100g溶于

700mL温蒸馏水中，冷却；将硫酸铜溶液搅拌下缓缓加入柠檬酸和碳酸钠混合液中，最后用蒸馏水稀释至1000mL。

四、操作步骤

(一)肝糖原的提取

称取1g左右新鲜动物肝脏至研钵中，加入少许石英砂以及1mL10%的三氯醋酸溶液，研磨至糜状再加入2mL5%的三氯醋酸继续研磨片刻，使成均匀糜浆，转入离心管中，2500r/min离心10min。取上清液于另一离心管中，加入等体积的95%乙醇，混匀后静置片刻，使糖原呈絮状析出，再放入离心机2500r/min离心10min。弃去上清液，将离心管倒置于滤纸上。

(二)肝糖原的鉴定

向肝糖原沉淀中加入1mL蒸馏水，用细玻棒搅拌至溶解，得糖原溶液。

1.取小试管2支，一支加入糖原溶液10滴，另一支加入蒸馏水10滴，然后两管再各加入碘液2滴，混匀。观察管中颜色变化，并解释现象。实验九琼脂糖凝胶电泳法凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料:琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺电泳一、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法二、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，三、实验材料、器具及药品以前实验中提取的小麦总DNA和质粒样品。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液四、实验步骤⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并摇匀。）⑵用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。⑶充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。⑸打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。⑹将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。植物总（核）DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带。质粒DNA应呈现一到三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区是样品中存有的RNA杂质。若质粒DNA样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。琼脂糖电泳的优点（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。（2）电泳速度快。（3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（4）样品易回收，常用于制备。配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围常用的电泳缓冲液4℃保存备用.常用的6X载样缓冲液Ⅰ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液实验十植物DNA的提取及鉴定一、SOS法（一）试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

（二）试验试剂：1Q+K-f

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1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。7e/D:S:E9C+^)t

2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

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3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。6T!B:x0q!d*K:e5\/p:u6T

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LN