分枝杆菌属、放线菌属与诺卡菌属的检验（临床微生物检验课件）

放线菌和诺卡菌属

细菌鉴定

学习目标１掌握放线菌属与诺卡菌属的微生物学检测要点２了解放线菌属与诺卡菌属微生物特性和临床意义。3放线菌是多数不致病，对人类致病的主要有放线菌属和诺卡菌属。放线菌属和诺卡菌属概述4放线菌与诺卡菌的区别特征放线菌诺卡菌培养特性厌氧/微需氧、需氧35℃~37℃生长20℃

~25℃

、或37℃均生长20℃

~25℃不生长抗酸性非抗酸性丝状菌弱抗酸性分布寄生口腔、上呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道存在外界环境如土壤、多为腐生菌感染性内源性感染外源性感染代表菌种衣氏放线菌.etc星形诺卡菌、巴西诺卡菌放线菌属和诺卡菌属概述51．厌氧或微需氧菌:G+、非抗酸性丝状菌2．不含分枝菌酸3．分布：人口腔、上呼吸道，等与外界相通的腔道，属正常菌群；4．致病菌：衣氏放线菌（A.israelii）

(一)放线菌属（Actinomyces）放线菌属细菌鉴定6临床意义正常菌群，条件致病，对人致病的主要是衣氏放线菌和牛型放线菌；慢性化脓性感染，常伴有多发性瘘管，排出黄色硫磺样颗粒；与龋齿、牙周炎有关。放线菌属细菌鉴定7微生物学检验主要：硫磺样颗粒（脓液、痰、分泌物）有颗粒：压片镜检：菊花状排列的菌丝必要：厌氧培养（缓慢、37℃培养2周以上）放线菌属细菌鉴定8微生物学检验标本采集：注意查找有无“硫磺颗粒”放线菌属细菌鉴定9硫磺样颗粒镜下观察颗粒呈菊花状；由中央和周围两部分组成；

革兰染色：中央为G+（紫蓝色）丝状体，周围为粗大的G-（红色）棒状体，呈放射状排列。苏木精伊红染色：中央为紫色，末端膨大，部分为红色。放线菌属细菌鉴定10微生物学检验分离培养：血平板、或牛心脑浸液琼脂培养基；

菌落特点：菌落质地致密，表面呈紧密的绒状，或坚实、干燥而多皱。由于基内菌丝长在培养基内，所以菌落与培养基结合较紧，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。放线菌属细菌鉴定11(二)诺卡菌属（Nocardia）1.专性需氧菌2.含分枝菌酸3.形态：与放线菌相似，但菌丝末端不膨大4.分布：土壤中，多数不致病菌5.致病菌星形诺卡菌（N.asteroides）巴西诺卡菌（N.brasiliensis）诺卡菌属细菌鉴定12临床意义侵入途径：呼吸道或皮肤创伤；所致疾病：诺卡菌病；外源性感染，好发于免疫缺陷患者；化脓性感染：肺部：肺炎、肺脓肿，等脑部：脑脓肿、脑膜炎等等……诺卡菌属细菌鉴定13微生物学检验色素颗粒压片(类似硫磺颗粒)：在感染的组织内及脓液中也为类似硫磺样颗粒，呈淡黄色、红色及黑色不等，称为色素颗粒。诺卡菌属细菌鉴定14涂片染色特点1：

革兰染色：革兰阳性杆菌，但着色不均；非常重要诺卡菌属细菌鉴定15涂片染色特点2：

抗酸染色：呈弱阳性，着色不均；非常重要诺卡菌属细菌鉴定16涂片染色特点3

：

菌丝断裂现象：陈旧培养染色时菌丝部分出现断裂成链杆状或球杆状，呈T形或V形排列；非常重要诺卡菌属细菌鉴定17分离培养：沙保罗琼脂、或普通琼脂培养基；

菌落特点：大小不等、表面干燥有皱褶、颗粒状、菌落边缘陷入培养基中；不同种类可产生不同色素（如橙红、黄等）诺卡菌属细菌鉴定18放线菌感染类型。。。。。。常见感染菌。。。。。。病理特点。。。。。。菌落特征。。。。。。染色特征。。。。。。诺卡菌感染类型。。。。。。常见感染菌。。。。。。病理特点。。。。。。菌落特征。。。。。。染色特征。。。。。。要点复习放线菌属和诺卡菌属细菌鉴定19课后思考题诺卡菌和放线菌的菌落特征及染色特性？诺卡菌属细菌鉴定非结核分枝杆菌鉴定

学习目标１了解非结核分枝杆菌的生物学性状２了解非结核分枝杆菌的致病特点３了解结核分枝杆菌的微生物学检查近期典型NTM医院感染事件1998年4月深圳市妇儿医院严重医院感染事件，共有166例患者发生龟分枝杆菌感染；1998年福建南平市某医院因玻璃注射器消毒不规范导致59人发生偶发分枝杆菌感染。

非结核分枝杆菌鉴定非结核分枝杆菌鉴定定义及特点

定义：

结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。

特点：

对酸、碱比较敏感

对常用的抗结核菌药物较耐受

生长温度不如结核分枝杆菌严格

多存在于环境中、为条件致病菌

可引起结核样病变而受关注

抗原与结核分枝杆菌有交叉非结核分枝杆菌鉴定分类根据菌落色素和生长速度分为4组：第Ⅰ组：光产色菌（堪萨斯、海）第Ⅱ组：暗产色菌（瘰疬、斯氏）第Ⅲ组：不产色菌（鸟-胞内、蟾蜍）第Ⅳ组：迅速生长菌（偶发、龟）非结核分枝杆菌鉴定致病性

致病特点：

以全身中毒症状和局部损伤为主；

AIDS患者通常并发感染，呈现播散性所致疾病：

肺病、淋巴结炎、皮肤病、骨病等非结核分枝杆菌鉴定NTM医院感染特点多发生于手术部位、注射部位聚集性、迁延性、难治性；感染人数多，伤口经久不愈；医院感染暴发常见菌：主要是快速生长分枝杆菌，以龟分枝杆菌、偶发分枝杆菌最为常见；基层医疗机构多见。

非结核分枝杆菌鉴定微生物学检验耐热触酶试验：区分结核分枝杆菌与NTM；NTM的实验室诊断可根据细菌生长速度、色素等表型特征进行初步鉴定、然后进行分子生物学诊断。非结核分枝杆菌鉴定结核分枝杆菌鉴定

学习目标１熟悉结核分枝杆菌的生物学性状２熟悉结核分枝杆菌的致病特点３掌握结核分枝杆菌的微生物学检查31

态生两魇之愁，娇袭一身之病。泪光点点，娇喘微微。娴静时如蛟花照水，行动处弱柳扶风。啥病？概述根据小说的描写，林黛玉患的应是一种慢性病。她“从会饮食时便吃药，到今日未断，请了多少名医修方配药，皆不见效”。“每岁至春分秋分之后，必犯旧疾”，并且病症主要表现是咳嗽、咳痰、数量不等的咯血。

肺结核！！！CaseReport概述结核分枝杆菌：又称“结核杆菌”，是人和动物结核病的病原菌；致命的美丽概述34放线菌目（Actinomycetates）：

分枝杆菌属(Mycobacterium)

放线菌属（Actinomyces）：

诺卡菌属

(Nocardia)分类：（1）含分枝菌酸

—诺卡菌属

—分枝杆菌属

—棒状杆菌属（2）不含分枝菌酸

—放线菌属概述一类细长弯曲的杆菌，因有分枝生长的趋势而得名主要特点：（1）细长弯曲，分枝状生长（2）细胞壁含有大量脂质（分枝菌酸）（3）抗酸染色呈阳性（4）生长大多缓慢（5）引起疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿分枝杆菌属概述IWGMT分类缓慢生长菌结核分枝杆菌群光产色菌暗产色菌不产色菌迅速生长菌不能培养菌麻风分枝杆菌概述37分枝杆菌属种类Runyon分类概述38

结核分枝杆菌

（Mycobacteriumtuberculosis）结核分枝杆菌鉴定39WeShouldRemember……结核是一个古老的传染性疾病，也是在基础理论、实验诊断方面较为落后的病种

------需努力！结核分枝杆菌鉴定MTB包括:

人结核分枝杆菌（M.tuberculosis）牛分枝杆菌（M.bovis）非洲分枝杆菌（M.africanum）坎纳分枝杆菌（M.canettii）田鼠分枝杆菌（M.microti）等前四种细菌对人类致病，其中人型MTB感染的发病率最高一、分类结核分枝杆菌概述

1.形态及染色

细长略弯曲、分支状、单个、条索状或短链状；

抗酸染色阳性，呈红色；

有荚膜；二、生物学性状结核分枝杆菌生物学特性2.培养特性：馋、懒、丑、顽、变馋：营养要求高，专性需氧,罗氏培养基。懒：生长缓慢，18h/代，2-4W可见菌落生长。丑：菌落乳白或米黄，表面粗糙呈菜花样。液体培养基：菌膜生长最适pH=6.5-6.8结核分枝杆菌生物学特性四抗抗干燥抗酸碱抗碱性染料抗青霉素四怕怕紫外线怕酒精怕抗痨药物怕湿热顽：对某些理化因素抵抗力较强结核分枝杆菌生物学特性形态结构变异典型形态－→细菌的L型卡介苗－→牛结核杆菌的减毒株毒力变异多重耐药的菌株（MDR-MTB）耐药性变异变：毒力、耐药性、形态等均可变异变异性结核分枝杆菌生物学特性糖类发酵试验（－）触酶试验（+）热触酶试验（－）3.生化反应与非结核分枝杆菌鉴别试验结核分枝杆菌生物学特性

全球

约1/3人口已感染

2000万活动性MTB患者年增900万年死亡300万（我国12.7万）结核分枝杆菌致病性卡介苗：

牛型结核杆菌经13年230代培养，制成减毒活菌苗（卡介苗），广泛用于预防接种。预防结核分枝杆菌致病性WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手结核分枝杆菌致病性49世界结核病日第19个世界防治结核病日主题：你我共同参与，依法防控结核——发现、治疗并治愈每一位患者不产生内、外毒素，无侵袭性的酶。四、致病性与免疫性结核分枝杆菌致病性传播与扩散通过各种途径，引起各种结核细菌呼吸道消化道破损皮肤粘膜扩散侵犯多种组织和器官引起相应的结核病体内血液淋巴管消化道支气管结核分枝杆菌致病性所致疾病肺部感染：肺结核肺外感染：脑、肾、骨、关节、生殖器官等

全身播散性结核

消化道结核

皮肤结核结核分枝杆菌致病性胞内感染菌，主要依赖细胞免疫；人类对结核杆菌的感染率很高，但发病率缺较低，这表明人体感染结核杆菌可获得一定的抗结核免疫力，但不能预防再感染；传染性免疫：结核分枝杆菌（或BCG）进入机体后使机体对细菌再次入侵有免疫力，而当细菌或其成分从体内彻底消失后机体的免疫力也随之消失。免疫性结核分枝杆菌致病性

荧光定量PCR

芯片杂交

分子生物学

抗原抗体检测细胞因子检测

免疫学

萋尼染色+荧光染色罗氏培养+分枝杆菌快速培养

病原学结核分枝杆菌鉴定五、微生物学检验

病原学检验是结核病确诊的主要依据！55诊断能力低结核分枝杆菌鉴定诊断方法落后结核分枝杆菌鉴定根据感染部位不同选择不同的标本肺结核---痰（晨痰，连续送检三次）肾或膀胱结核---尿液肠结核---粪便结核性脑膜炎---脑脊液脓胸、腹膜炎等---胸腹水废弃物处理：高压灭菌是首选1.标本采集结核分枝杆菌鉴定（1）形态学检查---染色镜检！1）直接涂片法

2）浓缩集菌涂片法（2）

核酸检测---PCR推荐使用结核分枝杆菌鉴定2.直接检查浓缩集菌痰液、尿、粪等涂片染色分离培养4%NaOH、3%HCl或6%H2SO4处理15min离心、沉淀结核分枝杆菌鉴定染色镜检涂片染色

（1）抗酸染色法：齐-尼（Ziehl-Neelsen）染色（2）荧光染色法：金胺O染色

最常用结核分枝杆菌鉴定

齐-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色原理

分枝杆菌细胞壁含脂质较多，染色时与石碳酸复红结合牢固，能抵抗3%盐酸酒精的脱色作用。初染5％石炭酸复红脱色3％盐酸酒精复染碱性美蓝结果分枝杆菌呈红色，其他细菌和背景物质为蓝色抗酸染色步骤结核分枝杆菌鉴定抗酸染色原理碱性复红脱色复染抗酸菌非抗酸菌结核分枝杆菌鉴定热染法冷染法经典方法方便、安全

关于抗酸染色的两种常见方法：结核分枝杆菌鉴定抗酸染色涂片结核分枝杆菌鉴定

结核分枝杆菌金胺“O”染色结核分枝杆菌鉴定半定量报告抗酸染色：抗酸杆菌（1000×）荧光染色：抗酸杆菌（450×）未找到抗酸菌00±1~2/300视野1~2/70视野1+1~9/100视野2~18/50视野2+1~9/10视野4~36/10视野3+1~9/视野4~36/视野4+>9/视野>36/视野

涂片镜检的报告方式结核分枝杆菌鉴定

浓缩集菌法涂片镜检结果如何向临床报告？结核分枝杆菌鉴定直接涂片时应在生物安全柜中操作！结果应报告：“（未）检出抗酸杆菌”！注意事项

涂片优点：

涂片缺点：敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以上抗酸菌才可得到阳性结果，故阳性率低。特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性”，不能区分结核和非结核分枝杆菌。傻：镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。假阴性：异烟肼治疗后TB会失去抗酸性！简便、快速、价廉、可作疗效评估结核分枝杆菌鉴定意义：是结核病病原学诊断的“金标准”！是开展进一步检测的基础，如药敏。结核分枝杆菌鉴定3.培养鉴定前处理：

目的：杀死杂菌、液化标本方法：4%NaOH法、等培养基选择：罗氏培养基、等接种培养：固体培养法、液体培养法结核分枝杆菌鉴定3.培养鉴定罗-琴培养基馋：含血清、蛋黄、马铃薯、等懒：2-5周丑：菜花样菌落2-5周后结核分枝杆菌鉴定药敏试验生化鉴定染色镜检报告方式培养结果—无细菌生长1+斜面20个菌落以上，占斜面1/4以下2+斜面上菌落生长面积占1/4以上，1/2以下3+斜面上菌落面积占斜面1/2以上，3/4以下4+斜面上菌落生长密集，成菌苔培养结果的报告方式结核分枝杆菌鉴定BACTECMGIT960优点：阳性率更高（较涂片法）报告时间更快：12-14d缩短药敏结果：6-12d结核分枝杆菌鉴定仪器法

培养优点：敏感性：高（较涂片法）特异性：高（较涂片法）可确证：是金标准！疗效评估：最后连续5次培养阴性--“治愈”！药敏：为后续药敏试验提供菌株。结核分枝杆菌鉴定

培养缺点：需时：常达8周！操作：复杂！（较涂片法）成本：高（较涂片法）生化反应噬菌体鉴定法分子生物学鉴定：

PCR、及其相关性技术，如PCR-RFLP、SSCP、etal.高效液相色谱法（HPLC）结核分枝杆菌鉴定4.鉴定结核菌素试验结核分枝杆菌抗原检测结核分枝杆菌抗体检测全血干扰素测定法

结核分枝杆菌鉴定5.免疫学诊断概念：是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核杆菌是否能引起变态反应的一种试验，以判断机体对结核杆菌有无免疫力。结核菌素试验结核分枝杆菌鉴定材料旧结核菌素(

oldtuberculin,OT)：结核杆菌加热处理后提取的粗制品，主要为结核菌蛋白纯蛋白质衍化物(purifiedproteinderivative,PPD)：三氯醋酸沉淀后的纯化物方法常规试验：OT或PPD5单位皮内注射前臂内侧硬结直径48-72h