微生物检验技术-真菌检验技术

真菌的分离培养

真菌培养是目前鉴定真菌的惟一方法。培养真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。菌落是鉴别真菌的方法。注意以下几点：①菌落性质：酵母菌还是霉菌；②菌落大小:病原性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；③菌落颜色:病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉,很少引起开裂。通过培养可确定菌种，辅助直接检查的不足；通常用沙保氏培养基（SDA）（22～28℃）；深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养；温度

:22℃～28℃(深部真菌:28℃/37℃)需氧、湿度高;PH:4.0～6.0(弱酸性)生长速度

:慢(1～4周见典型菌落)菌落特征

:酵母/酵母样菌

:光滑柔软、湿润;丝状菌:疏松(绒毛状、棉絮状、粉末状);颜色(正/背面)常用培养方法试管法---初代培养、菌种保存大培养---纯种的培养、研究小培养---菌种鉴定

(玻片法钢圈法方块法)真菌的生化反应主要用于深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。1.糖(醇)类发酵试验37℃孵育，观察糖发酵情况。

2.同化碳源试验糖同化试验是测定细菌生长是否利用某种糖或醇类物质作为唯一的碳源。

3.同化氮源试验

同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。

其他实验芽管形成试验

取少许待检的白色念珠菌接种于0.5ml人或兔血清中，混匀，直37℃水浴2-3h后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。厚壁孢子形成试验

本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯－80琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚膜孢子及假菌丝。白假丝酵母菌的厚膜孢子

芽生孢子Candidaalbicans--chlamydosporeformationoncornmealagar假丝酵母菌厚膜孢子动物实验血清学实验分子生物学实验快速实验技术的应用真菌体外药物敏感试验一、常量稀释法二、微量稀释法三、丝状真菌的体外药敏方法四、改良的真菌体外药物敏感试验方法真菌的有性孢子（根霉菌的接合孢子）假丝酵母菌菌落

青霉菌石膏样癣菌真菌的常规检验法实验室检查：标本采集分离培养直接镜检生化反应染色镜检免疫学试验以直接镜检和分离培养最重要。一、临床标本的采集

1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、皮屑等。

2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。

3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。

4．脓汁及渗出物。

1.采集的标本要适宜

不同真菌感染应采取不同的临床标本。

2.在用药前采集标本

一般真菌标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。二、采集标本注意事项

3.采集的标本量要足血液和脑脊液标本5ml，胸腔液20ml，皮屑标本两块，活体组织两份(一份送病理科检查，一份作镜检和培养)。4.严格无菌操作并进行消毒处理，尤其是采集血液和脑脊液标本，要避免污染杂菌。5.采集标本立即送检深部真菌标本最长不得超过2h。（一)直接镜检直接镜检对真菌病的诊断较细菌更为重要。许多真菌标本不需染色即可直接镜检，如癣病标本多用KOH湿片检查法，即取病发或病损部位皮屑、甲屑置于载玻片上，加1滴10％-20％KOH液，然后加盖玻片并微微加热，使标本组织溶解透明，在显微镜下可观察到真菌的孢子和菌丝。

三、标本直接检查

常用的封固液：①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）。③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。（二）染色标本检查：1、革兰氏染色：各种真菌均为革兰氏阳性，为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。2、乳酸酚棉蓝染色3、糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。4、嗜银染色（GMS）：染成黑色。

5、墨汁染色：主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。6、荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。

新型隐球菌直接镜检的意义直接镜检阳性表示：①有诊断意义，如浅部真菌病等；②看到的就是真菌的形态，可确定某些致病性