DB51T 1420-2012 动物细粒刺球蚴检疫技术规范 全血金标免疫渗滤法

动物细粒棘球蚴检疫技术规范——全血金标免疫渗滤法2012-03-30发布2012-05-01实施四川省质量技术监督局发布 12规范性引用文件 13术语和定义 14检测方法 2附录A(资料性附录)试剂的配制方法 4附录B(资料性附录)细粒棘球蚴囊液粗抗原制备 5 6工DB51/T14本标准由四川出入境检验检疫局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准发布。本标准起草单位：四川出入境检验检疫局、四川农业大学。本标准主要起草人：余华、杨光友、严玉宝、胡娟、崔鹏博、周岷江。1动物细粒棘球蚴检疫技术规范——全血金标免疫渗滤法本标准规定了动物细粒棘球蚴的检疫技术方法。本标准适用于动物细粒棘球蚴的全血金标免疫渗滤法检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541动物疫病实验室检验采样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准细粒棘球蚴Echinococcosisgranulosa指细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)的中绦期幼虫，它寄生于牛、羊等动物及人的肝脏和肺脏等部位，可引起动物和人的严重寄生虫病，即棘球蚴病(Hydatidosis)或称包虫病。全血金标免疫渗滤法DIGFA是一种检测全血标本的棘球蚴现场快速检测方法，它以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。全血金标免疫渗滤法方法是采用土豆凝集素与全血混合达到快速凝血的目的。4检测方法4.1试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。2氯金酸；抗检测动物IgG二抗；三羟甲基氨基甲烷(Tris);塑料小盒；吸水垫料；硝酸纤维素膜(NC膜);碳酸钾；土豆凝集素；5%的BSA封闭液，配制见附录A.5;PBS缓冲液，配制见附录A.6;PBST洗涤液，配制见附录A.7;受检动物细粒棘球蚴抗体阳性血清；受测动物细粒棘球蚴抗体阴性血清；硫酸铵沉淀法纯化的细粒棘球蚴囊液抗原(0.2mg/mL),配制见附录B。4.2仪器和设备高速冷冻离心机；移液枪；核酸蛋白仪；紫外分光光度计；金标喷点仪。4.3检测步骤4.3.1待检血样按照NY/T541“样品的采集”有关章节要求，采集每头待检动物全血5mL,加入0.01%的土豆凝集素(50μL),室温(20℃~26℃条件下操作)备用。4.3.2胶体金-抗抗体制备试剂配制0.01%氯金酸溶液配制见A.1;1%的柠檬酸三钠溶液配制见A.2;0.1moL/HCL配制见A.3。制备方法取0.01%氯金酸溶液100mL加热煮沸后，在剧烈搅拌下加入1%的柠檬酸三钠溶液3mL。待溶液变成葡萄酒红色后继续煮10min,冷却后以0.1moL/HCL调节pH至6.0,将抗抗体按照1:40的浓度加入胶体金中。迅速混匀10min后，加入1%的PEG(MV10000)使其浓度为0.05%,3000r/min离心5min,取上清12000r/min离心20min,弃上清，沉淀混悬于含1%BSA的PBS中，即为胶体金抗抗体结合物。34.3.3诊断膜制备硝酸纤维素膜(NC膜)(孔径0.3μm)用超纯水浸泡30min,取出晾干后用铅笔在膜上画出1cm见方的方格，用pH7.2的Tris-HCL缓冲液(配制见附录A.4)浸泡30min晾干后，根据需要剪成一定大小，将1μL制备好的棘球蚴囊液抗原(0.2mg/mL)点于NC膜膜片上方格中央，待室温下干燥后，用含5%的BSA的封闭液进行封闭，37℃干燥后置4℃冰箱保存。4.3.4渗滤装置组装将处理好的硝酸纤维素膜(NC膜)下垫一层吸水垫料，并压缩于塑料小盒内。4.3.5金标免疫渗滤操作将检测装置置于平板上，在NC膜中央滴加5μL的PBS缓冲液(0.02mol/LpH7.4)。待PBS缓冲液渗入，加5μL待测全血样本。待全血样本渗入，加10μLPBST洗涤液(pH7.4,含0.05%Tween-20的0.01molPBS)洗液洗去未结合抗体。待PBS缓冲液渗入，加胶体金标记抗IgG结合物1滴。待胶体金标记抗IgG结合物渗入，加10μLPBST洗涤液(pH7.4,含0.05%Tween-20的0.01molPBS)洗去未结合抗抗体。静置，肉眼观察结果。4.3.6结果判定肉眼观察，每次试验时均须设立阳性、阴性血样对照，对照成立方可判定结果。完成上述操作后，室温下(20℃~26℃条件下操作)静置10min后观察结果，直到硝酸纤维素膜(NC膜)抗原点显示出紫红色斑点。根据斑点颜色深浅可以标记为：+++深度为强阳性，艹深度为阳性，+深度为弱阳性，未出现斑点则为阴性。4(资料性附录)试剂的配制方法A.10.01%氯金酸溶液将1g氯金酸溶于100mL蒸馏水(氯金酸极易潮解)配成高浓度溶液，取1mL高浓度氯金酸溶液混合99mL蒸馏水配制成0.01%氯金酸溶液，置4℃保存。A.21%的柠檬酸三钠溶液1g柠檬酸三钠，溶于99mL蒸馏水，配制成1%的柠檬酸三钠溶液，置4℃保存。0.1mol/L的盐酸由36～37%的浓盐酸9mL,注入1000mL水摇匀，密闭储存。A.4pH7.2的Tris-HCL缓冲液Tris(三羟甲基氨基甲烷)2.4228g、800mL蒸馏水，再也HCl调节pH至7.2,再定容至1000mL,置于4℃保存。A.55%的BSA封闭液(100mL)取5gBSA(牛血清白蛋白),加PBS缓冲液定容至100mL,置于4℃保存。A.6PBS(pH7.4)缓冲液取KH₂PO₄·2H₂O0.2g,Na₂HPO₄·12H₂O2.9g,NaCl8.0g,KC10.2g,加蒸馏水至800mL,调节pH至7.4,加蒸馏水定容至1000mL,置于4℃保存。A.7PBST洗涤液取0.5mLTween-20加入1000mLPBS(pH7.4),搅拌混匀，置4℃保存。5(资料性附录)细粒棘球蚴囊液粗抗原制备从动物屠宰场采集寄生于动物(绵羊或牛)肝脏和肺脏的细粒棘球蚴包囊，在无菌条件下抽取囊液，除去上层脂类，反复冻融3次。并在冰浴中用9.5mm探头23KHZ超声粉碎两次，每次30sec。然后将抗原4000r/min离心30min,取上清液，经硫酸铵盐析，再用PBS(pH7.4,0.02mol/mL)透析。经核酸蛋白仪测定蛋白浓度为2.7mg/mL,冷冻保存。6[1]EckertJ,EpizooticsIO.WHO/OIEmanhealthproblemofglobalconcern.WorldOrganisationforAnimalHealthParis,2[2]郭志宏，彭毛，李永寿，等.青海省部分地区人包虫病的流行调查.中国动物检疫，2008,25[3]JiangC.Today'sregionaldistrib[4]杨炬，刘天锡.包虫病流行病学研究进展.宁夏医学杂志，2008,30(4):378-379.[5]ZhenghuanW,XiaomingW,XiaoqingL.EchinococcosisinChina,aReviewofthEchinococcusspp.Ecohealth,2008,5(2):115-126.[6]TorgersonP,DeplazesP.Echinococcosis:distudies.Trendsparasitol,2009,25(4):164-170.[7]贾红，刘丹，侯绍华，等.羊细粒棘球蚴病抗体间接ELISA检测方法的建立.畜牧兽医学报，2011,42(1):65-70.[8]ZhangW,LiJ,McManusDP.ConceptsinimmunologyanddiagnosisofhyMicrobiolRev,2003,16(1):18.[9]彭毛.玉树县放牧羊棘球蚴病感染情况调查.中国动物检疫，2009,(12):43-43.[10]BiavaM-P,M.F.,DaoM,AHU,A.,FortierM,PU-PH,B.Laboratorydiagnosisofcystichydaticdisease.Worldjournalofsurgery,2001,25(1):10-14.[11]康金凤，刘文杰小鼠细粒棘球蚴不育囊的超微结构观察.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，[12]Al-YamanFM,KnoblochJ.Isolationandpartialcharacterizationofcross-reactiveantigensofEchinococcusgranulosus[13]KanwarJ,KaushikS,SawhneyI,etal.Specificantibodiesinserumofpatientsrecognisedbyimmunoblotting.JMedmicrobio,1992,36(1):46.[14]EckertJ,DeplazesP.Biological,epidemiological,andclinicalaspectsofechinococcosis,azoofincreasingconcern.ClinMicrobiolRev,2004,17(1):107.[15]韩秀敏.国内包虫病免疫诊断技术进展.地方病通报，1997,12(3):87-90.antigensforrapidserodiagnosisofhu7[17]何金戈，邱加闽.纯化抗原和粗抗原诊断包虫病的效果比较.实用寄生虫病杂志，2002,10[18]邵锡如，肖乐义.固相金斑免疫试验检测包虫病血清抗体技术的初步建立.中国人兽共患病杂志，1998,14(2):51-51.[19]CarmenaD,BenitoA,ErasoE.Antigensfortheimmunodiagnosisinfection:Anupdate.Acttrop,2006,98(1):74-86.[20]聂华明，余华，严玉宝，杨光友，古小彬.棘球蚴病与棘球绦虫病诊断与检疫方法研究进展.中国动物检疫，2011,28:(10):69-74.[21]SiavashiMR,TaherkhaniH,RezaeiK,e