(高清版)DB22∕T 2051-2014 饲料中肉毒梭菌测定 PCR 方法　　

2014-02-28发布2014-04-30实施吉林省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国顺德出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邵秋荣、刘斌、周亮、刘晓晖、王潇、任明月。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义5.1引物：见表1。2表1引物序列目标菌类型引物序列上游引物：5'-GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3’下游引物：5'-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’上游引物：5'-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG-3'下游引物：5'-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3'上游引物：5'-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3'下游引物：5'-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3'上游引物：5'-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT-3'下游引物：5'-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3'5.2疱肉培养基：见附录A.1章。5.3胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤(TPGY):见附录A.2章。5.4厌氧卵黄琼脂：见附录A.3章。5.5细菌基因组DNA提取纯化试剂盒。5.7dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosp脱氧鸟苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脱氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脱氧胸苷三磷酸)。5.9蛋白酶K。5.11十二烷基硫酸钠(SDS)。5.12蔗糖。5.13三羟甲基氨基甲烷(Tris)。5.14乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na₂·2H₂O)。5.1510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化钾(KC1),15mmol/L氯化镁(MgCl₂)。5.19EDTA溶液，0.5mol/L,pH8.0:称取186.1gEDTA-Na₂·2H₂O,加入700mL去离子水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调pH值至8.0,用水定容到1L,分装后高压灭菌。5.20Tris-HCl,1mol/L,pH8.0:在800mL溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。5.21TE缓冲液(pH8.0):在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCI(pH8.0)和2mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0),用水定容到1L,分装后高压灭菌。5.22溶菌酶溶液：用TE配制，使用浓度为10mg/mL。5.2420%SDS溶液：将20gSDS溶解在100mL去离子水中。3DB22/T2051—20145.2550×TAE电泳缓冲液(储备液):称取484gTris,量取114.2mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0),溶于水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成1×TAE电泳缓冲液(工作液)。用10mL水溶解；称取蔗糖50g,用30mL水溶解，合并三种溶液，用水定容至100mL,在4℃保存。5.27阳性对照：含有扩增片段的质粒或A、B、E、6.3恒温培养箱：35℃±1℃和28℃±1℃。6.11天平：感量0.1g。7检测培养基中的氧，并迅速冷却，切勿摇动。每15mL增菌肉汤中接种1g~2g样品，接种时将接种物慢慢接入肉汤液面以下。每份样品接种两管疱肉培养基，置35℃±1℃,同时接种两管TPGY培养基，置28℃±1℃,厌氧培养5d。检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。若有生长，按7.2分用接种环取1环～2环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置厌氧条件下35℃±1℃培养48h。47.3DNA提取7.4DNA浓度测定…7.5PCR检验7.5.1PCR反应体系7.5.2反应条件7.5.3扩增产物电泳检测8结果判定511.1检验过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。6A.1疱肉培养基a)新鲜牛肉500.0gb)蛋白胨30.0gc)酵母浸膏5.0ge)葡萄糖3.0gA.1.2制法a)胰酪胨(trypticase)b)蛋白胨c)酵母浸膏d)葡萄糖e)硫乙醇酸纳7a)酵母浸膏50.0gc)蛋白胨20.0g分混合，存于4℃备用。A.3.3制法每500mL琼脂基础液(48℃~50℃)加80mL卵黄乳状液，充分混合，制成平板。室温放置2d,8B.1试剂B.1.1明胶磷酸盐缓冲液：明胶2g,磷酸氢二钠4g,蒸馏水1000mL。将上述成分加热溶解，调pH至6.2,121℃高压灭菌15