DB51T 2906-2022 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范

DB51TechnicalspecificationforisolationandidentificationofswinegaetavirusI 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 5 6本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定张睿、谢嘉宾、王英、文豪、徐凯、黄先奇、陈亮1猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范本文件适用于猪及其产品中盖塔病毒病原分离和鉴4缩略语BHK-21：乳仓鼠肾源细胞DNAmarker：DNA相对分子质量5.1.3BHK-21、DMEM培养基、FBS、HEPES缓冲液(1mol/L储存液)、0见附录A)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR反应混合液（2×)。25.2主要仪器设备微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、PCR仪、稳压稳流电泳仪和水平电液样品1mL~2mL，组织装入无菌自封样品袋或离心管，血液装入抗凝GETV分离鉴定时，应在高等级生物安全实验室操作，按照GB19489（所有部分）的规定执行。取0.5g~1g待检组织样品，加入1m作3:1（V/W）稀释。反复冻融3次后，4℃3000r/min离心10min，取上清液，以0.22μm无菌滤膜过滤除菌后，转入1.5mL离心管中，-70℃按常规法将BHK-21细胞分装在25cm2细胞培养瓶中，每瓶分装含8%FBS的DMEM培养基5mL，细胞浓度应为2×105个/mL~3×105个/mL，培养43积）。每份样品接种2瓶~4瓶细胞，另设细胞对照2瓶~4瓶。37°C吸附1h，弃上清，加入2ml含2%FBS每天观察记录CPE，通常在接种12h~48h内可出现CPE，胞形态基本正常或稍有衰老。若出现CPE，将接毒细胞反复冻融三病毒上清液，置-70℃保存，进行病毒核酸鉴定。若接种细胞第1代72h后未出现CPE，按上述收取，并使用反转录试剂盒将提取核酸反转录成cDNA，于-20）：下游引物（10µmol/L）：5’-GCACTCRAGGTCAT反应体系见表1，反应体系可根据表中各组分比513114取适量扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪中观察结果。9结果判定9.1RT-PCR9.2病毒分离鉴定9.2.1对核酸阳性扩增产物进行测序，其结果与附录B.1序列比酸检测，若核酸鉴定结果仍为阳性，且测序比对结果正确，则判定为GE5NaClNa2HPO4∙12H2O0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4℃冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍，成TAE电泳A.31.0%琼脂糖凝胶板制备厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，电6ACCGAAGAAGCCGAAGAAAAAGCCGCAAAAAGCGAAGGCTAAGAAAAACGAACAGCAAAAGAAGAACGAGAACAAGAAACCACCACCTAAGCAGAAGAACCCGGCTAAGAAGAAGAAACCAGGAAAAAGGGAACGCATGTGCATGAAGATAGAGAATGATTGCATCTTCGAGGTCAAGCTTGACGGTAAGGTCACGGGATACGCCTGCCTAGTCGGGGA