DB51T 2458-2018 大鲵蛙病毒病诊断技术规程

12018-04-18发布2018-05-01实施四川省质量技术监督局发布I II 1 13术语和定义 1 1 26临床检查 2 2 29病毒鉴定 3 4附录A(规范性附录)试剂配方 5附录B(资料性附录)大鲵蛙病毒MCP基因参考序列(531bp) 6Ⅱ本标准依据GB/T1.1-2009给出的规定进行编写。本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川农业大学。本标准起草人：耿毅、刘丹、余泽辉、陈德芳、黄小丽、欧阳萍、邓梦玲。1大鲵蛙病毒病诊断技术规程本标准规定了大鲵蛙病毒病诊断的术语与定义、试剂和材料、临床检查、实验室样品采集、病毒分离、病毒鉴定和综合判定等技术规程。本标准适用于大鲵蛙病毒病的诊断。2规范性引用文件下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法SC/T7014水生动物检疫实验技术规范SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于此文件。大鲵蛙病毒病指由大鲵蛙病毒(Chinesegiantsalamanderranavirus,CGSRV)感染引起的大鲵发病或死亡的一种病毒性疾病。细胞病变效应。EPCEpitheliomapapulosumcyprini鲤鱼上皮瘤细胞。主要外膜蛋白基因。4试剂和材料2用水应符合GB/T6682中一级水的规格。4.2试剂与培养基按GB/T4789.28与SC/T7014规定执行。鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)、小牛血清(FBS)、M199营养液、青霉素、链霉素、Mix-reactionbuffer、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。MCP基因序列PCR扩增引物：P1-F:5'-GACTTGGCCACTTAGA-3’,P1-R:5'-GTCTCTGGAGAAGAGAA-3’。-20℃保存。5设备和器械主要设备与器械如下：解剖盘、剪刀、镊子和手术刀、组织匀浆器、电子天平、高压灭菌锅、超净工作台、普通冰箱、超低温冰箱、一次性滤器(0.22μm)、倒置显微镜、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、水平电泳系统、凝胶成像系统与CO₂培养箱等。6临床检查6.1临床症状病鲵食欲减退，摄食减少，甚至停止摄食，部分病鲵出现呕吐，偶尔呕吐物混有血液；体表粘液分泌增多，活动缓慢，反应迟钝，常静卧池底。6.2外部检查病鲵全身性肿胀、出血，尤其头部与四肢明显，体表皮肤与肌肉溃烂，形成溃疡，严重时肿胀的四肢溃烂。6.3剖检口腔黏膜偶见出血与溃疡；腹腔常见淡黄色澄清或含血液体；肝肿大，淤血、出血，呈花斑状；脾肿大，严重瘀血呈紫黑色或散在灰白色坏死灶；肾肿大，斑点状出血；肺囊充血、出血；胃肠道呈出血性一卡他性炎。7实验室样品采集样品采集按SC/T7103与GB/T18088执行。体长≤5cm的大鲵苗取整条，体长5-10cm的大鲵苗取内脏(包括肾),体长≥10cm的大鲵则取肝、脾、肾。8病毒分离8.1样品处理3应在10℃以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆，再用细胞培养液PBS缓冲液(A.1)按1:10的最终稀释度组织悬液，加入100IU/ml双抗(青霉素、链霉素A.2)后，置4℃冰箱作用1-2h后，反复冻融3次，用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，滤液保存于-20℃或以下温度冷冻保存。8.2细胞接种与观察将上述滤液用细胞培养液(A.3)再做两次10倍稀释，然后将这1:10、1:100、1:1000三种稀释度的滤液，分别接种到生长24-48h的EPC单层细胞，按每2cm2的细胞单层接种100μL,的中，25°℃吸附1-2h后弃病毒液，然后加含2%FBS和100IU/ml双抗的M199细胞培养维持营养液(A.4),置于25℃培养。接种滤液后的细胞，7d内每天用倒置显微镜观察CPE出现情况。典型的CPE为细胞空泡、变圆、脱落。若细胞出现CPE,收集细胞液进行鉴定。若细胞在接毒后7d未出现CPE,盲传一次，再培养观察7d,未出现CPE的样品则判定为阴性。9病毒鉴定9.1样品处理对有临床症状的大鲵，按8.1的要求取样匀浆后取50mg-100mg于1.5mlEP管中；对出现CPE的细胞培的细胞培养物为阴性对照，用等体积的双蒸水作为空白对照。DNA提取可使用商品化的组织病毒DNA抽提试剂盒(按说明书操作),或使用传统酚-氯仿提取法，具体操作如下(传统法):a)将样品置于-40℃冰箱反复冻融3次，12000r×5min;b)取上清400μl,加入500μltris-饱和酚，充分混合，静置5min,12000r×5min,4℃;c)取上清加入饱和酚，氯仿各200μl,混匀，静置5min,12000r×5min,4℃。重复一次；d)取上清加入200μl氯仿，混匀，12000r×5min,4℃,此时将出现分层。如果中层蛋白多，则重复上一步骤；e)取上清加1-2倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置20min,12000r×5min,4℃;f)弃上清，用75%酒精洗涤，12000r×5min,4℃,重复操作一次；g)弃上清，操作台中自然晾干后，20-30μlTE溶解沉淀，-20℃保存，备用。9.3PCR扩增反应在PCR管中加入12.5μlMix-reactionbuffer,上下游引物各lμl(10umol/L),DNA模板lμl,加入9.5μl无菌双蒸水至25μl体积。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。混匀后，3000r/min离心30s。循环30次，最后72℃延伸1min,最后在72℃延伸10min,4℃保存。9.4琼脂糖凝胶电泳用TAE电泳缓冲液(A.5)配制1%的琼脂糖(A.6)平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液 (A.7)刚好淹没胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液(A.8)混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120V电泳约20-40min,当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察。4DB51/T2458—20189.5结果判定化与测序，若对PCR扩增产物纯化、测序，并与已知序列(附录B)比对，同源性达98%以上则为阳性，a)细胞培养出现典型CPE,PCR检测阳性；d)细胞培养出现典型CPE,PCR检测阳性；5(规范性附录)800mL超纯水中溶解8gNaCl,0.2gKCl,3.58gNa₂HPO₄-12H₂0,0.24gKH2P04,用1mol/LHCl调节pH为7.4,加超纯水定容至1L,高压灭菌，室温保存备用。将青霉素和链霉素霉素用超纯水配成各为10,000IU/mL浓度的混合储存液，经0.22μm孔径的滤膜过滤后分装，-20℃保存，使用时的工作浓度为100IU/mL。A.3M199营养液按说明书方法进行配制，按说明书加入一定量的NaHCOs调节营养液pH值为7.2,定容至1L,0.22μm滤器过滤除菌后分装，4℃保存备用。A.4细胞生长液(含10%胎牛血清的M199)、细胞维持液(含2%胎牛血清的M199)相应加入胎牛血清即A.5TE缓冲液(pH8.0)将0.121gTris碱(分子量121.1),0.0372g乙二胺四乙酸二钠(分子量372.24)加入80mL双蒸水中，加浓盐酸调节pH至8.0,加双蒸水定容至100mL,室温保存。A.61%琼脂糖凝胶琼脂糖1g中加入1xTAE缓冲液100mL,加热溶解后，加入5μLGoldenview混匀。A.750×TAE电泳缓冲液在400mL双蒸水中溶解121gTris碱，加入28.55mL冰乙酸