DB51T 2457-2018 斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程　

1DB51DB51/T2457—2018斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程2018-04-18发布2018-05-01实施四川省质量技术监督局发布I 1 1 1 1 2 2 2 2 2 4 5 6 81GB/T28630.4白斑综合征（WSD）SC/T7201.2鱼类细菌病检疫技术规程第2部分：柱状检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照GB/T4789.2Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg2+）、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司216SrRNA基因DNA序列扩增引物，P-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，P-R：5’-GGTTACCTTGTT3用硫酸软骨素-Shieh培养基，即含400μg/mL的硫酸软骨素溶液和1%的牛血清白9.2.10运动性震荡悬浮，加入50μL10％的SDS溶液（A.6加入100μL5mol/L的NaCl溶液（A.8充分混匀，再加入100μLCTAB/NaCl溶液（A.9）混匀，6液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1A.11混匀，12000r/min离心5min。取上清液，加入1倍体4混匀后，3000r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，35次循环；72℃胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液（A.13）混合后加入样品9.3.4.1.337℃水浴将冻结的凝胶9.3.4.1.5取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1A.11混匀，12000r/min离心5min。革兰氏染色为革兰氏阴性，菌体细长、弯曲或直的杆状，约(4～8)μm×(0.5～5—++ +—++++测定的16SrRNA基因序列与附录B所列的基因序列比6 BaCl2.2H2OK2HPO4KH2PO4配制Shieh培养基，于121℃灭菌20min，冷却至37℃后加入刚果红，使终浓度为30-50mg/mL。将0.121gTris碱（分子量121.1），0.0372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水7将29.22gNaCl（分子量58.444.1gNaCl溶解于80mL双蒸水中，缓将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE在400mL双蒸水中溶解121gTris碱，加入28.55mL冰乙酸和50ml0.5/LEDTA。再加双蒸水定容至将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴81agagtttgatcatggctcagg61ggtagaaggagcttgttcctttgag181gcctcatttgattattaaagttcc241tggtgtggtaacggcataccaaggcaacgatg301acactggtactgagacacggaccagactcctacg361aatgggcgcaagcctgaaccagccatgccgc421actgcttttgtacaggaagaaaccctcccttgtaag481aaggatcggctaactccgtgccagc541gaatcattgggtttaaagggtccgtaggcg601ctcaacgatcaaacggccattgatactgtaaga661atgtagtgtagcggtgaaatgcttagagattacatgg721actacgagtatattgacgctgatggacgaa781tgtattccaacgcccgtaaacg841cgaaagtgataagtatcccacctggggagtacgtt901gacgggggcccgcacaagcggag961taccanggcttaaatgggaaacgaca1081gcgcaacccctgttgc1201ac