生物化学课件 第九章 酶促反应动力学

第九章酶促反应动力学概述研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学研究酶结构和功能的关系以及酶的作用机制，需要动力学提供试验数据发挥酶促反应的高效率，寻找最为有利的反应条件酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制具有理论研究的意义和实践价值2024/12/29海洋生命学院22024/12/29海洋生命学院3一、化学动力学基础㈠反应速率及其测定单位时间内反应物的减少量或生成物的增加量表示用瞬时速率表示2024/12/29海洋生命学院4一、化学动力学基础㈡反应分子数和反应级数⒈反应分子数：反应中真正相互作用的分子数目。多为单分子或双分子反应⑴单分子反应：单一分子参加反应

A→P⑵双分子参加反应

A+B→P+Q

2024/12/29海洋生命学院5一、化学动力学基础㈡反应分子数和反应级数⒉反应级数：实验测得的表示反应速率与反应物浓度之间关系的概念⑴一级反应反应速率与浓度的关系能以单分子反应速率方程式来表示，可以是单、双分子、多分子参加反应.半衰期与反应物浓度无关，与反应速率常数有关，k单位为时间倒数

初浓度C02024/12/29海洋生命学院6水分子参与的双底物的反应由于水分子浓度大，反应的非限制性因素，符合一级反应2024/12/29海洋生命学院7一、化学动力学基础⒉反应级数⑵二级反应反应速率与反应物浓度的二次方或浓度乘积成正比关系，可以是双、多分子参加反应.半衰期与反应物浓度和反应速率常数成反比，k单位为mol-1.L.s-1

2024/12/29海洋生命学院8一、化学动力学基础⒉反应级数⑶零级反应反应速率与反应物浓度无关而受其他因素影响而改变的反应.半衰期与反应物浓度成正比和反应速率常数成反比，k单位为mol.L-1.s-1

2024/12/29海洋生命学院9二、底物浓度对酶反应速度的影响㈠中间络合物学说酶与底物反应时，通过特异识别作用，先形成酶底物复合物，然后再形成产物和酶分子，酶分子重新结合底物。该学说已得到大量实验证实，抗体酶产生；酶反应动力学特征等ES中间络合物2024/12/29海洋生命学院10一个有活性的酶一定含有相应的活性位点同反应的中间过渡状态相匹配EScomplexE-transitionstatecomplex2024/12/29海洋生命学院11二、底物浓度对酶反应速度的影响㈠中间络合物学说

1903年Henri等以反应速度对底物浓度作图得双曲线

[S]：底物浓度，v：反应速度，Vmax：最大反应速度

a.当底物浓度较低时，v与[S]成正比一级反应

b.随底物浓度增加，v不按正比升高混合级反应

c.再加大底物浓度，零级反应，酶已被饱和2024/12/29海洋生命学院12

增加底物浓度

21345678002

4

68底物

(mmole)产物806040200S+E↓P(在一定时间里)2024/12/29海洋生命学院131、米氏公式的推导

1913年Michaelis和Menten根据中间产物学说推导出一个数学表达式，表示了底物浓度与酶反应速度的定量关系通常称为米氏方程如下㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)E+S

ESE+PkS最大反应速率反应速率底物浓度底物常数2024/12/29海洋生命学院14k1k2k3k4E+S

ES

E+Pk1k21、米氏公式的推导

1925年Briggs和Haldane提出稳态理论，根据：“稳态平衡”理论反应分二步进行

㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)中间复合物形成产物形成反应系统中ES的生成速率和ES的分解速率相等时，复合物ES浓度保持不变的这种状态称稳态2024/12/29海洋生命学院15①1、米氏公式的推导

㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)E+S

ES

E+Pk1k2k3k4中间复合物形成产物形成在反应初期，ES形成时一般[S]＞＞[E]，[ES]非常小，(1)（[S]-[ES]）≈[S]；K4非常小，忽略不计(2)达到稳态平衡时，[ES]浓度不变，生成和分解量相等，此时酶的催化速度：v=k3[ES]最大反应速度：vmax=k3[E]②③④2024/12/29海洋生命学院161、米氏公式的推导平衡时，①=②

㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)代入③将④代入得米氏方程，Km米氏常数2024/12/29海洋生命学院171、米氏公式的推导⑴当[S]＜＜Km时，米氏公式为属一级反应动力学，酶未能被底物完全饱和，不适于测定酶活力⑵当[S]＞＞Km时，米氏公式为⑶当[S]=Km时，米氏公式为㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)零级反应，适于测定酶活力Km为最大反应速度一半时的底物浓度，单位mol/L2024/12/29海洋生命学院18Michaelis-Menten方程描述了观察到的速度曲线当[S]<<Km当[S]>>KmKm

是V0=Vmax/2时的底物浓度2024/12/29海洋生命学院192、动力学参数的意义⑴米氏常数的意义①Km值是酶的特征常数，只与酶本身性质有关，而与酶浓度无关，每种底物有一个特征的Km值，且对一定pH、温度和离子强度而言。②Km=k2/k1+k3/k1，当k3＜＜k2时，Km=k2/k1=Ks，1/Km值可近似的表示酶对底物亲和力，Km值最小的底物为酶的最适底物或天然底物；否则，Km=Ks+k3/k1，k3/k1为转化比率。③Km值实际用途：若已知某个酶的Km，就可以算出在某一底物浓度时，其反应速度相当于Vmax的百分率；计算出任何底物浓度下酶活性部位被底物饱和数fES=v/vmax=[S]/(Km+[S])㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)E+S

ES

E+Pk1k2k3k42024/12/29海洋生命学院202、动力学参数的意义⑴米氏常数的意义④Km值可以帮助确定某一代谢反应的方向和途径当一系列不同的酶催化连锁反应时，确定各种酶的Km及相关底物浓度，可有助于寻找限速步骤。㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)丙酮酸丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱羧酶乳酸脱氢酶乳酸乙酰辅酶A乙醛1.7×10-5mol/L1.3×10-3mol/L1.0×10-3mol/LABCD10-210-310-4当A、B、C浓度接近10-4时，限速步骤？丙酮酸浓度低时，反应方向？酶工程与代谢工程中改造酶的Km调控代谢途径（强化则降低Km，弱化则提升Km）2024/12/29海洋生命学院212、动力学参数的意义⑵Vmax和k3(kcat)的意义：

Vmax对特定的底物也是一个特征常数，pH、温度和离子强度等也影响Vmaxv=k3[ES]，[S]很大时，酶完全饱和，Vmax=k3[E0]，k3表示当酶被底物饱和时每秒种每个酶分子转换底物的分子数，叫作转换数，通称催化常数kcat。①当[S]＞＞Km，酶被完全饱和，v=kcat[E0]②当[S]=Km，v=1/2kcat[E0]③当[S]＜＜Km，酶被部分饱和，kcat/Km表示酶对不同底物的催化效率或称酶的专一性常数。体内条件下真实反应速度㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)或2024/12/29海洋生命学院222024/12/29海洋生命学院23VmaxKmSvo1/S1vo双倒数作图反应速度曲线

1)

用一定量的酶

→

E

2)

添加不同浓度的底物

→

S

(x轴)

3)

测定一定时间内的产物的生成量(P/t) →

vo

(y轴)

4)

(x,y)

根据曲线来估计最大反应速度

→

Vmax

5)

当

y=1/2Vmax

计算

x([S])

→

Km1Vmax-1Km1/2㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)2024/12/29海洋生命学院243、利用作图法测定Km、Vmax

⑴Lineweaver-Burk双倒数作图法㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)缺点：实验点过分集中在直线的左下方，低浓度S的实验点倒数后误差较大，偏离直线较远，影响Km和Vmax的准确性2024/12/29海洋生命学院25一个酶动力学参数测定实例Datano12340.250.501.02.00.420.720.800.92Absorbancev(mmole/min)[S]0.210.360.400.46(1)产物在

600nm测定(2)反应时间10min

速度底物

产物双倒数1/S1/v4210.52.081.561.351.16→→→→1.00.50v直接图双曲线2.01.001/v-4-20241/[S]012[S]1.0-3.82024/12/29海洋生命学院263、利用作图法测定Km、Vmax

⑵Eadie-Hofstee作图法㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)以v～v/[S]作图，Vv/[s]-KmVmax2024/12/29海洋生命学院273、利用作图法测定Km、Vmax

⑶Hanes-Woolf作图法㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)以[S]/V～[S]作图2024/12/29海洋生命学院283、利用作图法测定Km、Vmax

⑷Eisenthal和Cornish-Bowden直线作图法㈡酶促反应的动力学方程式(单底物)把[S]标在横轴的负半轴上，测得的V标在纵轴上，并将两点连线，交点坐标为（Km，Vmax）优点：直观，易判断误差较大的点KmVmax2024/12/29海洋生命学院291.酶与反应物分子间的关系可以恰当地表述成（）A.一种临时性的结合；B.由共价键稳定的结合；C.酶在其中发生永久性改变的一种结合；D.随机的非互补结合；2.下列有关酶催反应说法中不正确的是（）A.与底物形成酶-底物复合物；B.降低反应的活化能；C.加快反应速度，缩短反应时间；D.当与底物结合时许多酶的形状都稍有改变；E.达到平衡时比没有加入酶的反应能产生更多产物。2024/12/29海洋生命学院30某些酶的Km值由于代谢产物存在而发生改变，而这些代谢产物在结构上与底物无关。当[S]远大于Km时V趋向于Vmax，此时只有通过增加[E]来增加V2024/12/29海洋生命学院311、酶促反应按底物分子数的分类

单底物双底物三底物2、多底物反应按动力学机制分类

有序反应随机反应㈢酶促反应的动力学方程式(多底物)序列反应乒乓反应2024/12/29海洋生命学院322、多底物反应按动力学机制分类⑴序列反应：底物的结合和产物的释放有一定的序列，产物不能在底物完全结合前释放。①有序反应（Orderedreaction)或OrderedBiBi，酶与底物有序结合形成三元复合物，随后有序的释放出产物。㈢酶促反应的动力学方程式(多底物)EABPQAEAEBQEPQE脱氢酶属于此类型，乙醇+NAD+NADH+乙醛+H+乙醇脱氢酶2024/12/29海洋生命学院332、多底物反应按动力学机制分类⑴序列反应：②随机反应：RandomBiBi，底物随机与酶结合，随机释放。㈢酶促反应的动力学方程式(多底物)EAB2024/12/29海洋生命学院342、多底物反应按动力学机制分类⑵乒乓反应：酶E同底物A结合并生成产物P和修饰化的酶E’，E’再与底物B结合生成产物Q和酶E。㈢酶促反应的动力学方程式(多底物)EABE’QAEPE’E’BQEP转氨酶为典型。2024/12/29海洋生命学院352024/12/29海洋生命学院36⒊双底物反应的动力学方程⑴乒乓反应机制的动力学方程根据稳态学说可推导出动力学方程㈢酶促反应的动力学方程式(多底物)2024/12/29海洋生命学院37⒊双底物反应的动力学方程⑵序列机制的动力学根据稳态学说可推导出动力学方程㈢酶促反应的动力学方程式(多底物)①交点在横坐标以上说明A的表观Km随B浓度的增加而减小；②交点在横坐标以下说明A的表观Km随B浓度的增加而增大；③交点在横坐标上说明A和B的浓度互不影响彼此的Km。2024/12/29海洋生命学院38三、酶的抑制作用㈠抑制程度的表示方法

相对活力分数：a=vi/v0

相对活力百分数：a%=vi/v0×100%

抑制分数：i=1-a=1-vi/v0

抑制百分数：i%=(1-a)×100%㈡抑制作用类型1、不可逆抑制作用与酶蛋白上基团共价结合，使之失活，不能用超滤透析的方法去除，实质是酶的修饰抑制。分为专一性不可逆抑制作用，非专一性不可逆抑制作用。2024/12/29海洋生命学院39㈡抑制作用类型2、可逆抑制作用

抑制剂与底物结合是可逆的可以用透析除去⑴竞争性抑制作用：抑制剂与底物竞争酶的结合位点，从而影响底物与酶的结合。可通过增加底物浓度缓解抑制作用

2024/12/29海洋生命学院40㈡抑制作用类型2、可逆抑制作用⑵非竞争性抑制

酶可以同时与底物和抑制剂结合，两者没有竞争作用，结合位点不同，不能通过增加底物浓度来缓解抑制作用

重金属离子对酶抑制属该种类型2024/12/29海洋生命学院41㈡抑制作用类型2、可逆抑制作用⑶反竞争性抑制

酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，多见于多底物反应2024/12/29海洋生命学院42㈡抑制作用类型3、可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别⑴透析、超滤、凝胶过滤⑵动力学方法加入一定量的抑制剂，测定不同浓度的反应速度，以初速度对酶浓度作图。2024/12/29海洋生命学院43㈢可逆抑制的动力学1、竞争性抑制

Vmax不变，Km变大，表观现象为酶对底物的亲和力减小E+SESPE+k1ki2k3+IEIki1VmaxV[S]无抑制剂加竞争性抑制剂KmK’m2024/12/29海洋生命学院44㈢可逆抑制的动力学2、非竞争性抑制

Km不变，Vmax变小E+SESPE+km+IEIS+IEI+SkmkikiKmSVmaxVmax无抑制剂加非竞争性抑制剂2024/12/29海洋生命学院45㈢可逆抑制的动力学3、反竞争性抑制

Vmax，Km均变小

E+SESPE+km+IEISkiKmSVmaxV’max无抑制剂加反竞争性抑制剂K’m1/[S]-1/Km(1+[I]/Ki）[I]正常2024/12/29海洋生命学院46EnzymeInhibition(Mechanism)CompetitiveNon-competitiveUncompetitiveEEDifferentsiteCompeteforactivesiteInhibitorSubstrateCartoonGuideEquationandDescription[I]bindstofree[E]only,andcompeteswith[S];increasing[S]overcomesInhibitionby[I].[I]bindstofree[E]or[ES]complex;Increasing[S]cannotovercome[I]inhibition.[I]bindsto[ES]complexonly,increasing[S]favorstheinhibitionby[I].E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EI

←

↑E+S

→

ES

→

E+P++

I

I↓↓EI

+

S

→EIS

←

↑

↑E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EIS

←

↑XJuangRH(2004)BCbasics2024/12/29海洋生命学院47KmEnzymeInhibition(Plots)CompetitiveNon-competitiveUncompetitive

DirectPlotsDoubleReciprocalVmaxVmaxKmKm’[S],mMvo[S],mMvoIIKm[S],mMVmaxIKm’Vmax’Vmax’VmaxunchangedKmincreasedVmaxdecreasedKmunchangedBothVmax&KmdecreasedI1/[S]1/Km1/vo1/

VmaxITwoparallellinesIIntersectatXaxis1/vo1/

Vmax1/[S]1/Km1/[S]1/Km1/

Vmax1/vo

IntersectatYaxis=

Km’JuangRH(2004)BCbasics2024/12/29海洋生命学院48㈣一些重要的抑制剂1、不可逆抑制剂⑴非专一性不可逆抑制剂①有机磷化合物：与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合②有机汞、砷化合物：与酶分子活性部位的巯基共价结合③氰化物、硫化物和CO：与酶分子中金属离子形成稳定的络合物，如细胞色素氧化酶Fe2+④重金属：巯基、羧基有关，高浓度引起蛋白质变性。⑤烷化剂：烷化剂含有的活泼原子，引起酶的巯基、氨基、羧基、咪唑基等。⑥青霉素：与糖肽转肽酶活性部位丝氨酸羟基共价结合，使酶失活。2024/12/29海洋生命学院49㈣一些重要的抑制剂1、不可逆抑制剂⑵专一性不可逆抑制剂①Ks型不可逆抑制剂（亲和试剂）具有底物类似结构可和酶结合，其带有的活泼基团能与酶分子的必需基团反应，抑制酶的活性。由于其与酶的结合程度取决于Ks，因此称Ks型不可逆抑制剂胰蛋白酶2024/12/29海洋生命学院50㈣一些重要的抑制剂1、不可逆抑制剂⑵专一性不可逆抑制剂②Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物）此类抑制剂具有与天然底物类似的结构，而且本身与酶结合可以发生变化，变化使潜在活性基团暴露，作用于活性基团或辅基，使酶不可逆失活。丙氨酸消旋酶，催化L-Ala变为D-Alaγ-氨基丁酸转氨酶β-内酰胺酶抗青霉素2024/12/29海洋生命学院51㈣一些重要的抑制剂2、可逆抑制剂竞争性抑制剂