DB51T 1546-2012 植物检疫实验室常规检验技术 真菌　

DB51DB51/T1546—2012植物检疫实验室常规检验技术真菌2012-12-20发布2013-03-01实施四川省质量技术监督局发布I前言 1 1 1 2 2 2 2 39结果判定 3附录A(资料性附录)真菌病害主要症状特征 4附录B(资料性附录)真菌病害显微镜检查 6附录C(资料性附录)真菌病害染色检验 7附录D(资料性附录)真菌病害分离培养检验 8本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则进行编写。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局发布。本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。本标准主要起草人：宁红、李小松、刘可、赵兰鸰、帅波、黄玲、熊玉兰、杨重渝、袁曦。12规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB15569-2009农业植物调运检疫规程3术语和定义3.1病原真菌plantpathogenicfungi植株受病原菌侵染后，内部生理活动和外观上的生长发育呈现出某种异常状态。3.3病征sign病原菌在植物受害部位产生的结构特征。3.4菌丝和菌丝体hyphaandmycelium真菌的典型营养体，通常呈丝状，单根的叫菌丝，菌丝的集合体叫菌丝体。3.5子实体fruitbody真菌产生孢子的结构，如子囊果、担子果、分生孢子器、分生孢子盘、子座等，统称为子实体。3.7无性孢子asexualspore23.9柯赫氏法则Koch'sRule——乳酚油(苯酚结晶20mL,乳酸20mL,甘油40mL,蒸馏水20mL)——酒精(70%、95%)——龙胆紫(0.04%)——酒精冰醋酸混合液(95%酒精20mL,冰醋酸20mL)——苯胺蓝水溶液(苯胺蓝0.1g,蒸馏水100mL)—水合氯醛水溶液(水合氯醛5g,蒸馏水2mL)——升汞水溶液(升汞1g,浓盐酸2.5mL,蒸馏水1000mL)——福尔马林醋酸酒精固定液(FAA)(95%酒精20mL,福尔马林5mL,冰醋酸5mL,蒸馏38检测方法8.1症状观察观察样品有无异样，初步判断是否具有真菌病害的表现特征(见附录A),持扩大镜观察感病植株8.2显微镜检查8.3染色检验8.4保湿培养切取的培养物放在玻棒上，置于25℃~28℃恒温箱中培养一定时间，待培养物长出菌丝或子实体进行8.5分离培养见附录D。将分离得到的纯培养物制成孢子(或菌丝)悬浮液，通过喷雾、涂抹或针刺的方法将病原菌接种到相同品种的健株上，保湿约24h~48h,诱发寄主发病。然后再从接种发病的植株上再次分离得到其纯9结果判定9.2根据染色检验、保湿培养或分离培养，镜检观察病原菌的形态学特征，符合某种病害的病原菌特9.3采用柯赫氏法则判定，如寄主在接种后产生与原发病害一致的典型症状，并能从典型症状上再次分离到与接种物性状一致的病原菌，根据病原菌形态学特征，可判定为该类病害。4(资料性附录)真菌病害主要症状特征A.1白粉类花、果、叶及嫩枝上覆盖白色粉状物，后期在白粉物上出现散生状针头大的颗粒，颗粒由白变黄，最后变黑。A.2煤污叶、枝、果实表面覆盖一层煤烟状物，用手容易擦掉，这种病A.5白绢A.6斑点A.7炭疽A.8畸形植物受害部位变大或缩小，生长不匀，失去原来形状，后期在受害部位出现病征。发生在枝干皮层，病斑形状有圆形、近圆形、长形，通常病斑周围稍隆起，中间组织死亡，下陷，干裂，后期常产生小黑点或盘状物。5发生在乔灌木的枝干或根部木质部，使木质部变质、变色、腐朽，树干内因木质部腐朽出现空洞，受害部位表面后期往往出现大型真菌繁殖体，如木耳、蘑菇或马蹄状等各种形状繁殖体。分为湿腐和干腐。多汁部位破坏解体后产生湿腐或软腐症状；含水量低的植物组织软硬部位病死后产生的组织死亡称为干腐，在枝干上常与溃疡相似。A.12猝倒和立枯大多出现在播种育苗的苗木上。小幼苗根茎部发生腐烂使植物猝然倒伏，由于发生过程迅速，地上部分仍维持正常状态，称为猝倒；若幼苗根茎已木质化，茎部腐烂后不倒伏，地上叶子干枯，称为立枯。6(资料性附录)真菌病害显微镜检查B.1菌丝体和子实体的挑取检视显微镜下检视，常用浮载剂有蒸馏水、乳酚油和甘油乳酸等。检查叶片表面的真菌(如白粉菌、锈菌或其它霉菌等),采用粘贴检视的方法。将小段透明胶带粘贴在有真菌生长部位的叶面上，将胶带取下放在载玻片上的一滴甘油乳酸中，上面再加一滴甘油乳酸，B.3组织整体透明检视将小块病组织放在等量的酒精冰醋酸混合液中固定24h,再浸在饱和的水合氯醛水溶液中，待组织透明后取出用水洗净，经稀苯胺蓝水溶液染色，用甘油乳酸作浮载剂镜检。B.4徒手切片镜检选择软硬适中的植物器官或组织为材料，直接切成长约2cm～3cm的小段，切片断面不超过3mm²~5mm²。对于柔嫩的器官组织(如幼叶),可夹在通草、木髓和胡萝卜中进行切片。切片前先准备好一个盛有清水的培养皿；切片时用左手的拇指、食指与中指捏住材料，使材料突右手将刀片平稳地放在左手食指上，刀口向内，与材料切面保持平行，再用右7(资料性附录)C.1苯胺蓝乳酚油染色法挑取少量菌丝置于载玻片上，用加有0.1%苯胺蓝的乳酚油作浮载剂，将载玻片微微加热，盖上盖玻片，显微镜观察真菌孢子或菌丝隔膜。如果染色太深，可用未加染料的C.2龙胆紫染色法将病组织的徒手切片置于FAA固定液中固定染色25min~45min,用水冲洗后制片观察。8D.1培养基制备D.1.1种类D.1.1.1清水培养基琼胶15～20gD.1.1.2马铃薯葡萄糖琼胶培养基葡萄糖(或蔗糖)10g琼胶17～20gD.1.1.3燕麦片琼胶培养基琼胶17～20gD.1.2制备方法D.1.2.1清水培养基制备方法在1000mL沸水中，加琼胶熔化后根据需要分装灭菌保存。D.1.2.2马铃薯葡萄糖琼胶培养基制备方法将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000mL,然后加糖和琼胶，加热使琼胶完全熔化后，趁热用纱布过滤，根据需要分装三角瓶或试管灭菌保存。D.1.2.3燕麦片琼胶培养基制备方法将燕麦片加水1000mL,在沸水浴上加热1h,纱布过滤后加水补足1000mL,加琼胶熔化后根据需D.2分离培养检测法D.2.1分离工作的准备打开超净工作台通风20min以上，用70%酒精擦拭手、台面和工作台出风口进行消毒，分离培养所需的用具用95%酒精擦拭后用火焰灼烧灭菌。9D.2.2.1叶斑病害——从病健交界处切取边长约5mm的小块病组织备用。D.2.2.2维管束组织病害D.2.2.3根腐病害——小材料可参照D.2.2.1,大材料可参照D.2.2.2。——多肉的根、茎和果实等可参照D.2.2.2。D.2.2.5种子病害——取整粒种子或种子的一部分备用。D.2.3平板的制作将培养基加热融化，取出摇匀，在超净工作台上经无菌操作将培养基倒入已灭菌的培养皿中，厚度2mm~3mm,摇匀，静置冷却。可在10mL培养基中加入3滴25%乳酸，或加入40ug/mL链霉素防D.2.4分离培养D.2.4.1组织分离法将分离的材料置于已灭菌的培养皿内，先在70%酒精中浸2s~3s,再放入0.1%升汞溶液处理30s~10min(根据材料大小、坚实程度不同有所差异),再用灭菌水清洗3～4次，用灭菌滤纸吸干材料上的D.2.4.2稀释分离法此方法适