无菌检查及微生物检查方法验证课件

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介绍内容

一、微生物的基础知识二、无菌检查方法三、无菌检查及微生物检查方法验证4-无菌及微生物检查方法验证

微生物基础知识

微生物（microorganism,microbe）是一些肉眼看不见的微小生物的总称。微生物（microorganism）包括细菌、支原体、螺旋体、衣原体、立克次体、病毒及真菌（霉菌、酵母菌和放线菌）等。4-无菌及微生物检查方法验证

细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式繁殖。4-无菌及微生物检查方法验证

细菌的形态

⒈细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百倍至上千倍才能观察。⒉一般以微米（µm）作为测量单位。⒊在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌和螺杆菌。⒋经革兰染色法（Gramstain）可将细菌分成两大类：即革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。4-无菌及微生物检查方法验证

真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在基质上生长的形态称为菌落。4-无菌及微生物检查方法验证

真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。4-无菌及微生物检查方法验证

药品污染常见的真菌

毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属一、毛霉属（MucorMicheliexFries）

毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。

4-无菌及微生物检查方法验证根霉属（RhizopusEhrenberg）

根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。4-无菌及微生物检查方法验证

曲霉属（Aspergillus）

曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚有色物质，为有隔的多细胞。本属的常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的致癌性。

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青霉属菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属的常见产毒霉菌有9个种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；4-无菌及微生物检查方法验证

霉菌菌落形态4-无菌及微生物检查方法验证

霉菌在孟加拉红培养基上的形态4-无菌及微生物检查方法验证

酵母菌显微镜下形态4-无菌及微生物检查方法验证

无菌检查法

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

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无菌保障

试验环境

检验依据

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隔离系统的应用

应用隔离系统重要的目的⒈是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次检出的要求。⒉是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。4-无菌及微生物检查方法验证

培养基

硫乙醇酸盐流体培养基

改良马丁培养基

0.5%葡萄糖肉汤培养基

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制备培养基的要求

⒈培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度1/2。⒉培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。⒊配制好的培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。4-无菌及微生物检查方法验证

培养基的贮存

制备好的培养基应在2-25℃、避光保存；保存在非密容器中，应在3周内使用；保存在密闭容器中，可在1年内使用。4-无菌及微生物检查方法验证

培养基的适用性检查

无菌性检查每批培养基随机取不少于5支，培养14天应无菌生长。试验可与无菌试验同时进行。灵敏度检查

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菌种菌液制备黑曲霉菌液的制备培养基接种参照中国药典2010版

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结果判断空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。试验同时应做空白对照

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稀释液、冲洗液

0.1%蛋白胨水溶液

pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。4-无菌及微生物检查方法验证

阳性对照根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌抗革兰阴性菌抗厌氧菌抗真菌

加菌量

结果判断4-无菌及微生物检查方法验证

阴性对照供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。4-无菌及微生物检查方法验证

无菌检查法

包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。4-无菌及微生物检查方法验证

薄膜过滤法

过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤也可使用一般薄膜过滤器。选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性。4-无菌及微生物检查方法验证⒈可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品。⒉水溶性供试品直接过滤。⒊可溶性固体制剂供试品。⒋装有药物的注射器供试品和具有导管的医疗器具的供试品。4-无菌及微生物检查方法验证

直接接种法

供试品按规定量分别接入含培养细菌和真菌培养基的容器中，除另有规定外，每个容器中的培养基量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%。同时硫乙醇酸盐培养基不得少于15ml、改良马丁培养基不得少于10ml，培养基用量和高度应经方法验证。4-无菌及微生物检查方法验证

培养及观察

培养14天，如果培养基浑浊或培养14天后从外观不能判断是否长菌，可取该培养液适量转种至同种培养基或斜面上，培养细菌2天、真菌3天，观察有无菌生长或镜检进行判断。阴性对照不得有菌生长。4-无菌及微生物检查方法验证

结果判断

⒈若供试品管均澄清，或虽显浑浊无菌生长，判供试品符合规定。⒉若供试品中任何1管显混浊并确证有生长供试品不符合规定。⒊除非能充分证明，检出的微生物非供试品所含。⒋当符合下列至少一个条件时，方可判复试。

4-无菌及微生物检查方法验证⑴对无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。⑵回顾无菌实验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；⑶阴性对照管有菌生长。⑷供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。⑸试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定，若有菌生长判供试品不符合规定。4-无菌及微生物检查方法验证

方法验证的必要性⒈为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确的检验方法是至关重要的。因此试验前必须对选择的方法进行验证。⒉证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方法适宜于被检供试品的微生物污染的检验。

药品无菌检查和微生物检查方法验证4-无菌及微生物检查方法验证

检验结果的影响因素⒈供试品的组分⒉环境影响⒊检验方法⒋检验条件4-无菌及微生物检查方法验证⒈我国无菌和微生物检验方法验证的概况

⒉国外无菌和微生物检验方法验证的概况

⒊国外无菌和微生物检验方法验证的概况

4-无菌及微生物检查方法验证

药品微生物检验方法验证的基本要求

验证试验的设计需综合全面考虑，主要有以下几方面；⑴供试品特性⑵检验目的⑶试验全方面验证

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当验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试品对微生物无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品检验结果可真实的体现。4-无菌及微生物检查方法验证

⑷重新验证

药品的生产工艺、制剂组分、检验方法或检验条件发生改变时，应重新进行验证，以确认所发生的变化不影响该药品中的微生物检查。4-无菌及微生物检查方法验证

验证试验用菌株的要求

⑴验证试验用菌株应有代表性。⑵试验菌株应选择非致病性菌株。⑶试验菌宜选择比较稳定、重现性强的菌株。⑷菌株传代次数不得超过第五代。

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试验用菌株的储藏

菌种保藏的原则根据微生物菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但不至于死亡，以减低菌种的变异率。4-无菌及微生物检查方法验证

标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按验证的方法进行。

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低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。标准储备菌株经纯度和特性确认后保存时，可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分装于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥，液氮储存，超低温冷冻(低于-70℃)等方法保存。

4-无菌及微生物检查方法验证

冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再次使用。工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。4-无菌及微生物检查方法验证

不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：4-无菌及微生物检查方法验证⑴

挑选特征典型的纯菌菌落。⑵确定保藏的合适菌体形态。⑶选择最适宜的方法保藏。⑷定期对保藏的菌种进行检查。4-无菌及微生物检查方法验证

菌种的传代和使用

工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止过度的传代造成菌种变异。

1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。4-无菌及微生物检查方法验证

菌种的管理

1、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较强的责任心。4-无菌及微生物检查方法验证2、实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；

包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。4-无菌及微生物检查方法验证3、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。

4、由专人按操作规程和有关要求定期进行传代，并定期对保存的菌种进行检查，一般每年

1～2次，（或定期更换冻干菌种）。

4、发现菌种的异常情况应及时检查。一旦发现菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。并详细记录4-无菌及微生物检查方法验证

菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证明和登记，并包装严密。菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。4-无菌及微生物检查方法验证

菌悬液的制备与保存

参照《中国药典》2010版附录菌悬液的制备与保存。4-无菌及微生物检查方法验证

供试品抑菌活性的处理对含抑菌活性的供试品在进行微生物检查前，应对抑菌活性进行处理，验证试验可根据供试品的物理或化学特性选择下述方法来消除抑菌活性；⒈培养基稀释法⒉中和法⒊薄膜过滤法⒋离心沉淀法4-无菌及微生物检查方法验证

无菌检查法方法验证

目的：以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查，保证检验结果的可靠性．

何时验证：当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。4-无菌及微生物检查方法验证

验证方法

验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。4-无菌及微生物检查方法验证

菌种及菌液制备

参照《中国药典》2010版附录无菌检查法方法验证菌悬液的制备与保存。

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验证方法薄膜过滤法⑴过滤⑵接种培养基⑶对照试验⑷培养4-无菌及微生物检查方法验证

直接接种法、结果判断、处理方法参照《中国药典》2010版附录无菌检查法方法。

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微生物限度检查方法验证4-无菌及微生物检查方法验证

目的：增加试验方法的完整性、保证检验结果的可

靠性。

何时验证：建立供试品的微生物限度检查法时；供

试品的组分或原检验条件发生改变可能影响

检验结果时。

细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证4-无菌及微生物检查方法验证

验证方法菌液制备50～100cfu/ml。验证方法试验组、菌液组、供试品对照组、稀释剂对照组。结果判断供试品组、对照组、稀释剂对照组的菌回收率均不低70%。4-无菌及微生物检查方法验证

验证方法

⑴按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。⑵对各试验菌的回收率应逐一进行验证。⑶验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。4-无菌及微生物检查方法验证试验菌株大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌。菌液制备

同计数培养基的适用性检查。4-无菌及微生物检查方法验证

（1）试验组

①平皿法

②薄膜过滤法（2）菌液组

（3）供试品对照组（4）稀释剂对照组4-无菌及微生物检查方法验证结果判断

在3次独立的平行试验中⑴稀释剂对照组的菌数回收率应均不低于70%。⑵试验组的菌数回收率均不低于70%。⑶若试验组的菌数回收率低于70%，应采用其他方法或使用联合方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。4-无菌及微生物检查方法验证

验证试验存在的问题及处理方法

存在问题

进行验证试验时，因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败。4-无菌及微生物检查方法验证

处理方法

①验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作