DB45T 2581-2022 番茄黄化曲叶病毒RT-PCR检测方法

ICS65.020.01452022-08-25发布IDB45/T2581—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。本文件由广西壮族自治区农业农村厅归口。本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所。本文件主要起草人：甘桂云、蒋雅琴、李韦柳、康德贤、王益奎、李文嘉、蔡健和、韦福征、黎炎、吴永官。1DB45/T2581—2022番茄黄化曲叶病毒RT-PCR检测方法本文件界定了番茄黄化曲叶病毒RT-PRC检测方法所涉及的术语和定义，规定了番茄黄化曲叶病双生病毒RT-PCR检测方法的仪器与试剂、采样与样品处理、病毒DNA提取与检测、PCR扩增检测、结果描述及判定的要求。本文件适用于广西壮族自治区行政区域内番茄及其近缘属种植株番茄黄化曲叶病毒的检测。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1番茄黄化曲叶病TomatoYellowLeafCurl番茄黄化曲叶病由番茄黄化曲叶病毒（TomatoYellowLeafCurlVirus）引起，主要症状是植株生长缓慢，节间缩短，植株明显矮化，叶片变小，顶端叶片发黄并且上卷，整片叶萎缩、褶皱，坐果量减少，果实变小产生畸形，不能正常转色，果实产量和商品性大幅度降低。4仪器与试剂4.1检测仪器包括但不限于以下内容：——PCR仪；——电泳仪；——凝胶成像系统；——高速台式冷冻离心机(最高转速15000r/min以上)；——紫外分光光度计；——超净工作台；——冰箱(4℃和-80℃两种)；——通风橱；——配套移液器吸头，Eppendorf离心管(1.5mL)；——研钵。2DB45/T2581—20224.2检测试剂除特别说明外，下列试剂均为分析纯。如下：a)DNA提取液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl,2％(w/v)CTAB，4％PVP，40mmol/L巯基乙醇；b)TE缓冲液：含10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)；c)50×TAE电泳缓冲液：242gTris，57.1mL冰醋酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)定容至1000mL，使用时配制成1×TAE稀释缓冲液；d)溴化乙锭(EB，1mg/mL)：戴手套(双层)谨慎称取EB20mg于棕色试剂瓶中，加入20mL无菌水，溶解后用黑色袋子包好贮于4℃备用，每100mL凝胶加50μLEB；e)苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)；f)氯仿：异戊醇(24:1)；g)异丙醇；h)70％乙醇：用无水乙醇和双蒸水配制；i)琼脂糖凝胶。5采样与样品处理5.1采样5.1.1检测样品以单个品种为单位，以1000株为单位，每1000株采10个样，1000株以下10个样（10株），重点采集有疑似症状且无其它病虫害的叶片。对无症状植株采用对角线取样法，每条对角线等距离取5个样（5株）。5.1.2阴性对照样阴性对照取自脱毒试管苗或种植于网室内的已检测无黄化曲叶病的单株番茄。5.1.3阳性对照样阳性对照选取有矮化、叶片稍褪绿发黄，变小，叶片边缘上卷，叶片增厚等症状的叶片。5.2标识与保存样品统一使用封口袋保存，每个单株样品各置放一个封口袋中，每个品种再统一放在封口袋内。写好标签，注明采样时间、地点、品种、采集人。确保样品干燥，如能24h送至检测地，则送检样品常温保存，送至检测地于-80℃保存；超过一个工作日，送检样品采后需马上冷藏，送至检测地于-80℃以下冰箱保存。应避免反复冻融（冻融不超过3次）。6病毒DNA提取与检测6.1DNA提取6.1.1取0.2g叶片，放入预冷的研钵，并倒入适量液氮研磨，将研碎的叶片转入2mL编号离心管并加入65℃预热的提取液1mL，65℃水浴45min后12000r/min离心10min。3DB45/T2581—20226.1.2取上清液于1支干净的1.5mL离心管中，加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，摇匀后12000r/min离心10min。6.1.3取上清液于1支干净的1.5mL离心管中，加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，摇匀后12000r/min离心10min。6.1.4取上清液于1支干净的1.5mL离心管中，等体积氯仿:异戊醇(24:1)，摇匀后12000r/min离6.1.5取上清液于1支干净的1.5mL离心管中，加入等体积预冷过的异丙醇，轻柔混匀后于-20℃下静止1h，最后于4℃下10000r/min离心10min。6.1.6弃上清液，沉淀物用70％乙醇洗涤沉淀2～3次，在超净台吹干，用100μLTE溶解沉淀，保存于-20℃冰箱。6.2DNA检测6.2.1琼脂糖检测1％琼脂糖凝胶电泳(EB30μL，电压110V)20min～30min后，观察凝胶成像系统中是否有DNA谱带。6.2.2分光光度计检测分光光度计检测A260/A280的比值（OD260/OD280）值在1.8～2.0时认为得到的DNA纯度较高，稀释DNA浓度至50ng/L。7PCR扩增检测7.1PCR扩增7.1.1模板以提取的总DNA为模板，扩增反应总体积为20μL，其中包括：DNA模板2μL，10×PCRbuffer2μL，25mmol/L的MgCl22μL，10mmol/L的dNTP2μL，5μmol/L的上下游引物各2μL（TYLCV-F：5’-ACGCATGCCTCTAATCCAGTGTA-3’；TYLCV-R：5’-CCAATAAGGCGAAGCGTGTAGAC-3’），ddH2O补足至20μL。按比例配置好体系后于PCR仪中进行PCR扩增。7.1.2程序扩增程序如下：a)94℃预变性3min；b)94℃变性，30s，56℃复性，30s，72℃延伸，30s，30个循环；c)最后72℃延伸10min，4℃保存。7.1.3成像PCR产物用含有核酸染料的1.2％琼脂糖在120V电压下电泳40min，最终结果在凝胶成像系统上显示。7.2PCR检测每次检测包含两个阳性对照、两个阴性对照、检测样品和两个空白样品(ddH2O)。于1.8％～2.5％琼脂糖凝胶电泳(EB30μL，电压130V)20min～40min，观察是否有543bp特异目的片段扩增条带出现，是否与预期的扩增产物片段大小相吻合。4DB45/T2581—20227.3结果分析条件判定结果中如果两个阳性对照有特异目的片段扩增条带出现，且目的片段大小与预期的扩增产物大小相吻合，为543bp，而两个阴性对照样品与两个空白样品(ddH2O)都没有特异目的片段扩增条带出现时，结果有效。否则，此次实验检测结果无效。8结果描述及判定8.1阴性没有543bp特异目的片段扩增带出现，表示样品中无番茄黄化