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DB41DB41/T1586—2018饲料中志贺氏菌的检测EMA-PCR法2018-04-17发布2018-07-17实施河南省质量技术监督局发布I14.32×PremixTaq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25a）上游引物：5＇-TTGCTGCTGATGCCACTGAGA-3';4.10叠氮溴化乙锭（EMA，0.2mg/mL见附录A的A.4。4.11溴化乙锭（10mg/mL）。4.12灭菌离心管：1.5mL，15mL。25.4离心机：转速≥12000r/min。上，卤素灯照射下曝光1min，然后水浴煮沸10min，再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却。涡旋混匀裂解物，12000r/min离心2min，收集上清液，作为PCR扩增的模板（模板称取1.5g琼脂糖（4.5）加入100mL1×TAE电泳缓冲与1μL6×上样缓冲液（4.9）混合后加入到上样孔内，设Marker2000（4.6）对照。5V/cm～8V/cm恒压下电泳20min～30min。3如果志贺氏菌阳性对照的PCR产物在386bp处出现条带（参见附录B），同时阴性对照PCR产物于样品的PCR产物电泳后在386bp处出现条带样品的PCR产物电泳后在386bp处未出现条带，判定25g样品中未检出志贺氏菌。4培养基和试剂A.1.1成分20g1g2g5g0.5g4g1.5g5g水1000mLA.1.2制法将以上成分混合加热溶解，冷却至25℃左右调节至pH7.0±0.2。115℃高压灭菌15min。A.2.1成分242.0g37.2g57.1mL942.9mLA.2.2制法调节至pH8.3，定容至1L后，室温保存。使用时稀释50倍即为A.3.1成分0.5g0.5g0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.06mL360mL5灭菌水640mLA.3.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL灭菌水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与甘油混合，定容至1000mL，分装后4℃保存。A.4.1成分叠氮溴化乙锭5mg灭菌水25mLA.4.2制法5mg叠氮溴化乙锭溶于5mL灭菌水中，定容至25mL，充分混匀，分装后-20℃避光保存。6(资料性附录)志贺氏菌活

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